Ang pagkakaiba-iba ng diagnosis ng mga pulmonary nodules na kinilala ng computed tomography (CT) ay nananatiling isang hamon sa klinikal na kasanayan.Dito, nailalarawan namin ang pandaigdigang metabolome ng 480 na mga sample ng serum, kabilang ang mga malusog na kontrol, benign lung nodules, at stage I lung adenocarcinoma.Ang mga adenocarcinoma ay nagpapakita ng mga natatanging metabolomic na profile, samantalang ang mga benign nodule at malulusog na indibidwal ay may mataas na pagkakapareho sa mga metabolomic na profile.Sa pangkat ng pagtuklas (n = 306), ang isang hanay ng 27 metabolites ay nakilala upang makilala ang pagkakaiba sa pagitan ng mga benign at malignant na nodules.Ang AUC ng discriminant na modelo sa panloob na pagpapatunay (n = 104) at panlabas na pagpapatunay (n = 111) na mga grupo ay 0.915 at 0.945, ayon sa pagkakabanggit.Ang pathway analysis ay nagsiwalat ng tumaas na glycolytic metabolites na nauugnay sa pagbaba ng tryptophan sa lung adenocarcinoma serum kumpara sa mga benign nodules at malusog na kontrol, at iminungkahi na ang tryptophan uptake ay nagtataguyod ng glycolysis sa mga selula ng kanser sa baga.Itinatampok ng aming pag-aaral ang halaga ng mga serum metabolite biomarker sa pagtatasa ng panganib ng mga pulmonary nodules na nakita ng CT.
Ang maagang pagsusuri ay mahalaga upang mapabuti ang mga rate ng kaligtasan ng buhay para sa mga pasyente ng kanser.Ang mga resulta mula sa US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) at ang European NELSON Study ay nagpakita na ang screening gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) ay maaaring makabuluhang bawasan ang lung cancer mortality sa mga high-risk group1,2,3.Dahil ang malawakang paggamit ng LDCT para sa screening ng kanser sa baga, ang insidente ng mga incidental radiographic na natuklasan ng asymptomatic pulmonary nodules ay patuloy na tumaas 4 .Ang mga pulmonary nodule ay tinukoy bilang mga focal opacities hanggang sa 3 cm ang lapad 5 .Nahihirapan kami sa pagtatasa ng posibilidad ng malignancy at pagharap sa malaking bilang ng mga pulmonary nodules na nakita nang hindi sinasadya sa LDCT.Ang mga limitasyon ng CT ay maaaring humantong sa madalas na follow-up na eksaminasyon at maling positibong resulta, na humahantong sa hindi kinakailangang interbensyon at labis na paggamot6.Samakatuwid, mayroong pangangailangan na bumuo ng maaasahan at kapaki-pakinabang na mga biomarker upang matukoy nang tama ang kanser sa baga sa mga unang yugto at maiiba ang karamihan sa mga benign nodule sa paunang pagtuklas 7 .
Ang komprehensibong molecular analysis ng dugo (serum, plasma, peripheral blood mononuclear cells), kabilang ang genomics, proteomics o DNA methylation8,9,10, ay humantong sa lumalaking interes sa pagtuklas ng mga diagnostic biomarker para sa kanser sa baga.Samantala, ang mga metabolomics approach ay sumusukat sa mga cellular end na produkto na naiimpluwensyahan ng endogenous at exogenous na mga aksyon at samakatuwid ay inilapat upang mahulaan ang pagsisimula at kinalabasan ng sakit.Ang Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) ay isang malawakang ginagamit na pamamaraan para sa mga pag-aaral ng metabolomics dahil sa mataas na sensitivity nito at malaking dynamic range, na maaaring sumaklaw sa mga metabolite na may iba't ibang katangian ng physicochemical11,12,13.Bagama't ginamit ang pandaigdigang pagsusuri ng metabolomic ng plasma/serum upang matukoy ang mga biomarker na nauugnay sa diagnosis ng kanser sa baga14,15,16,17 at pagiging epektibo ng paggamot, 18 ang mga serum metabolite classifier upang makilala ang pagitan ng benign at malignant na mga nodule sa baga ay nananatiling pinag-aralan.- malawakang pananaliksik.
Ang Adenocarcinoma at squamous cell carcinoma ay ang dalawang pangunahing subtype ng non-small cell lung cancer (NSCLC).Ang iba't ibang pagsusuri sa CT ay nagpapahiwatig na ang adenocarcinoma ay ang pinakakaraniwang histological na uri ng kanser sa baga1,19,20,21.Sa pag-aaral na ito, gumamit kami ng ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) upang magsagawa ng metabolomics analysis sa kabuuang 695 serum sample, kabilang ang mga malusog na kontrol, benign pulmonary nodules, at CT-detected ≤3 cm.Pagsusuri para sa Stage I lung adenocarcinoma.Natukoy namin ang isang panel ng serum metabolites na nakikilala ang lung adenocarcinoma mula sa mga benign nodules at malusog na kontrol.Ang pathway enrichment analysis ay nagsiwalat na ang abnormal na tryptophan at glucose metabolism ay karaniwang mga pagbabago sa lung adenocarcinoma kumpara sa mga benign nodules at malusog na kontrol.Sa wakas, itinatag at napatunayan namin ang isang serum metabolic classifier na may mataas na pagtutukoy at pagiging sensitibo upang makilala sa pagitan ng malignant at benign pulmonary nodules na nakita ng LDCT, na maaaring makatulong sa maagang diagnosis ng pagkakaiba-iba at pagtatasa ng panganib.
Sa kasalukuyang pag-aaral, ang mga sample ng serum na tugma sa kasarian at edad ay retrospective na nakolekta mula sa 174 malusog na kontrol, 292 mga pasyente na may benign pulmonary nodules, at 229 na mga pasyente na may stage I lung adenocarcinoma.Ang mga demograpikong katangian ng 695 na paksa ay ipinapakita sa Karagdagang Talahanayan 1.
Tulad ng ipinapakita sa Figure 1a, isang kabuuan ng 480 na mga sample ng serum, kabilang ang 174 malusog na kontrol (HC), 170 benign nodules (BN), at 136 yugto I lung adenocarcinoma (LA) sample, ay nakolekta sa Sun Yat-sen University Cancer Center.Discovery cohort para sa hindi naka-target na metabolomic profiling gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS).Tulad ng ipinakita sa Karagdagang Larawan 1, ang mga pagkakaiba-iba ng metabolite sa pagitan ng LA at HC, LA at BN ay nakilala upang magtatag ng isang modelo ng pag-uuri at higit pang galugarin ang pagsusuri sa pagkakaiba-iba ng landas.104 na mga sample na nakolekta ng Sun Yat-sen University Cancer Center at 111 na mga sample na nakolekta ng dalawang iba pang mga ospital ay sumailalim sa panloob at panlabas na pagpapatunay, ayon sa pagkakabanggit.
isang populasyon ng Pag-aaral sa discovery cohort na sumailalim sa global serum metabolomics analysis gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS).b Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) ng kabuuang metabolome ng 480 serum sample mula sa study cohort, kabilang ang mga malusog na kontrol (HC, n = 174), benign nodules (BN, n = 170), at stage I lung adenocarcinoma (Los Angeles, n = 136).+ESI, positive electrospray ionization mode, -ESI, negative electrospray ionization mode.c–e Metabolites na may makabuluhang magkakaibang kasaganaan sa dalawang ibinigay na grupo (two-tailed Wilcoxon signed rank test, false discovery rate adjusted p value, FDR <0.05) ay ipinapakita sa pula (fold change > 1.2) at asul (fold change <0.83) .) na ipinapakita sa graphic ng bulkan.f Hierarchical clustering heat map na nagpapakita ng makabuluhang pagkakaiba sa bilang ng mga annotated metabolites sa pagitan ng LA at BN.Ang source data ay ibinibigay sa anyo ng source data file.
Ang kabuuang serum metabolome ng 174 HC, 170 BN at 136 LA sa pangkat ng pagtuklas ay nasuri gamit ang pagsusuri ng UPLC-HRMS.Una naming ipinakita na ang mga sample ng quality control (QC) ay mahigpit na kumpol sa gitna ng isang hindi pinangangasiwaang principal component analysis (PCA) na modelo, na nagpapatunay sa katatagan ng pagganap ng kasalukuyang pag-aaral (Karagdagang Larawan 2).
Tulad ng ipinapakita sa bahagyang hindi bababa sa mga parisukat-discriminant analysis (PLS-DA) sa Figure 1 b, nalaman namin na mayroong malinaw na pagkakaiba sa pagitan ng LA at BN, LA at HC sa positibong (+ESI) at negatibong (−ESI) electrospray ionization mode .nakahiwalay.Gayunpaman, walang nakitang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng BN at HC sa +ESI at -ESI na mga kondisyon.
Nakakita kami ng 382 differential features sa pagitan ng LA at HC, 231 differential features sa pagitan ng LA at BN, at 95 differential features sa pagitan ng BN at HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0.05 at multiple change >1.2 o <0.83) (Figure .1c-e )..Ang mga taluktok ay karagdagang na-annotate (Karagdagang Data 3) laban sa isang database (mzCloud/HMDB/Chemspider library) sa pamamagitan ng halaga ng m/z, oras ng pagpapanatili at paghahanap ng mass spectrum ng fragmentation (mga detalye na inilarawan sa seksyon ng Mga Paraan) 22 .Sa wakas, 33 at 38 na annotated metabolites na may makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ay nakilala para sa LA kumpara sa BN (Larawan 1f at Pandagdag na Talahanayan 2) at LA kumpara sa HC (Karagdagang Larawan 3 at Karagdagang Talahanayan 2), ayon sa pagkakabanggit.Sa kaibahan, 3 metabolites lamang na may makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ang nakilala sa BN at HC (Karagdagang Talahanayan 2), na naaayon sa overlap sa pagitan ng BN at HC sa PLS-DA.Ang mga differential metabolite na ito ay sumasaklaw sa isang malawak na hanay ng mga biochemical (Karagdagang Larawan 4).Kung pinagsama-sama, ang mga resultang ito ay nagpapakita ng mga makabuluhang pagbabago sa serum metabolome na sumasalamin sa malignant na pagbabago ng maagang yugto ng kanser sa baga kumpara sa mga benign lung nodules o malusog na mga paksa.Samantala, ang pagkakapareho ng serum metabolome ng BN at HC ay nagmumungkahi na ang mga benign pulmonary nodules ay maaaring magbahagi ng maraming biological na katangian sa mga malulusog na indibidwal.Dahil sa ang epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutations ay karaniwan sa lung adenocarcinoma subtype 23, hinahangad naming matukoy ang epekto ng mga mutation ng driver sa serum metabolome.Pagkatapos ay sinuri namin ang pangkalahatang metabolomic na profile ng 72 mga kaso na may katayuan ng EGFR sa pangkat ng adenocarcinoma ng baga.Kapansin-pansin, natagpuan namin ang maihahambing na mga profile sa pagitan ng mga pasyente ng mutant ng EGFR (n = 41) at mga pasyente ng wild-type na EGFR (n = 31) sa pagsusuri ng PCA (Karagdagang Larawan 5a).Gayunpaman, nakilala namin ang 7 metabolites na ang kasaganaan ay makabuluhang binago sa mga pasyente na may mutation ng EGFR kumpara sa mga pasyente na may wild-type na EGFR (t test, p <0.05 at pagbabago ng tiklop> 1.2 o <0.83) (Karagdagang Larawan 5b).Ang karamihan sa mga metabolite na ito (5 sa 7) ay mga acylcarnitine, na gumaganap ng mahalagang papel sa mga landas ng oksihenasyon ng fatty acid.
Tulad ng inilalarawan sa daloy ng trabaho na ipinakita sa Figure 2 a, ang mga biomarker para sa pag-uuri ng nodule ay nakuha gamit ang hindi bababa sa ganap na mga operator ng pag-urong at pagpili batay sa 33 na kaugalian na metabolite na nakilala sa LA (n = 136) at BN (n = 170).Pinakamahusay na kumbinasyon ng mga variable (LASSO) – binary logistic regression model.Sampung beses na cross-validation ang ginamit upang subukan ang pagiging maaasahan ng modelo.Ang pagpili ng variable at regularization ng parameter ay isinasaayos sa pamamagitan ng posibilidad na maximization na parusa na may parameter na λ24.Ang pagsusuri sa pandaigdigang metabolomics ay higit na isinagawa nang nakapag-iisa sa panloob na pagpapatunay (n = 104) at panlabas na pagpapatunay (n = 111) na mga grupo upang subukan ang pagganap ng pag-uuri ng discriminant na modelo.Bilang isang resulta, 27 metabolites sa hanay ng pagtuklas ang nakilala bilang ang pinakamahusay na modelo ng diskriminasyon na may pinakamalaking ibig sabihin ng halaga ng AUC (Larawan 2b), kung saan 9 ang tumaas na aktibidad at 18 ang nabawasan na aktibidad sa LA kumpara sa BN (Fig. 2c).
Workflow para sa pagbuo ng pulmonary nodule classifier, kabilang ang pagpili ng pinakamahusay na panel ng serum metabolites sa discovery set gamit ang binary logistic regression model sa pamamagitan ng ten-fold cross-validation at pagsusuri ng predictive performance sa internal at external validation sets.b Cross-validation statistics ng LASSO regression model para sa metabolic biomarker selection.Ang mga numerong ibinigay sa itaas ay kumakatawan sa average na bilang ng mga biomarker na napili sa isang ibinigay na λ.Kinakatawan ng pulang tuldok na linya ang average na halaga ng AUC sa kaukulang lambda.Ang mga gray na error bar ay kumakatawan sa minimum at maximum na mga halaga ng AUC.Ang may tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng pinakamahusay na modelo na may 27 napiling biomarker.AUC, lugar sa ilalim ng kurba ng receiver operating characteristic (ROC).c I-fold ang mga pagbabago ng 27 napiling metabolites sa LA group kumpara sa BN group sa discovery group.Pulang haligi - pag-activate.Ang asul na column ay isang pagtanggi.d–f Receiver operating characteristic (ROC) curves na nagpapakita ng kapangyarihan ng discriminant na modelo batay sa 27 kumbinasyon ng metabolite sa discovery, internal, at external validation set.Ang source data ay ibinibigay sa anyo ng source data file.
Ang isang modelo ng hula ay nilikha batay sa mga timbang na coefficient ng regression ng 27 metabolites na ito (Karagdagang Talahanayan 3).Ang pagsusuri ng ROC batay sa 27 metabolites na ito ay nagbunga ng isang lugar sa ilalim ng curve (AUC) na halaga na 0.933, ang sensitivity ng grupo ng pagtuklas ay 0.868, at ang pagtitiyak ay 0.859 (Fig. 2d).Samantala, kabilang sa 38 annotated differential metabolites sa pagitan ng LA at HC, ang isang set ng 16 metabolites ay nakamit ang isang AUC na 0.902 na may sensitivity ng 0.801 at pagtitiyak ng 0.856 sa discriminating LA mula sa HC (Karagdagang Larawan 6a-c).Ang mga halaga ng AUC batay sa iba't ibang mga threshold ng pagbabago ng fold para sa mga differential metabolites ay inihambing din.Natagpuan namin na ang modelo ng pag-uuri ay pinakamahusay na gumanap sa diskriminasyon sa pagitan ng LA at BN (HC) kapag ang antas ng pagbabago ng fold ay nakatakda sa 1.2 kumpara sa 1.5 o 2.0 (Karagdagang Larawan 7a, b).Ang modelo ng pag-uuri, batay sa 27 mga pangkat ng metabolite, ay karagdagang napatunayan sa panloob at panlabas na mga cohort.Ang AUC ay 0.915 (sensitivity 0.867, specificity 0.811) para sa internal validation at 0.945 (sensitivity 0.810, specificity 0.979) para sa external validation (Fig. 2e, f).Upang masuri ang kahusayan ng interlaboratory, 40 mga sample mula sa panlabas na cohort ay nasuri sa isang panlabas na laboratoryo tulad ng inilarawan sa seksyon ng Mga Paraan.Ang katumpakan ng pag-uuri ay nakamit ang isang AUC na 0.925 (Karagdagang Larawan 8).Dahil ang lung squamous cell carcinoma (LUSC) ay ang pangalawang pinakakaraniwang subtype ng non-small cell lung cancer (NSCLC) pagkatapos ng lung adenocarcinoma (LUAD), sinubukan din namin ang napatunayang potensyal na utility ng metabolic profile.BN at 16 na kaso ng LUSC.Ang AUC ng diskriminasyon sa pagitan ng LUSC at BN ay 0.776 (Karagdagang Larawan 9), na nagpapahiwatig ng mas mahinang kakayahan kumpara sa diskriminasyon sa pagitan ng LUAD at BN.
Ipinakita ng mga pag-aaral na ang laki ng mga nodule sa mga imahe ng CT ay positibong nakakaugnay sa posibilidad ng malignancy at nananatiling pangunahing determinant ng paggamot ng nodule25,26,27.Ang pagsusuri ng data mula sa malaking cohort ng pag-aaral ng screening ng NELSON ay nagpakita na ang panganib ng malignancy sa mga paksang may mga node na <5 mm ay katulad din ng sa mga paksang walang node 28 .Samakatuwid, ang pinakamababang sukat na nangangailangan ng regular na pagsubaybay sa CT ay 5 mm, gaya ng inirerekomenda ng British Thoracic Society (BTS), at 6 mm, gaya ng inirerekomenda ng Fleischner Society 29 .Gayunpaman, ang mga nodule na mas malaki sa 6 mm at walang halatang mga benign na tampok, na tinatawag na indeterminate pulmonary nodules (IPN), ay nananatiling isang malaking hamon sa pagsusuri at pamamahala sa klinikal na kasanayan30,31.Susunod naming sinuri kung ang laki ng nodule ay nakakaimpluwensya sa mga lagda ng metabolismo gamit ang mga naka-pool na sample mula sa pagtuklas at panloob na mga cohort ng pagpapatunay.Nakatuon sa 27 napatunayang biomarker, inihambing muna namin ang mga profile ng PCA ng HC at BN sub-6 mm metabolomes.Natagpuan namin na ang karamihan sa mga puntos ng data para sa HC at BN ay nag-overlap, na nagpapakita na ang mga antas ng serum metabolite ay magkapareho sa parehong mga grupo (Larawan 3a).Ang mga tampok na mapa sa iba't ibang mga saklaw ng laki ay nanatiling natipid sa BN at LA (Larawan 3b, c), samantalang ang isang paghihiwalay ay naobserbahan sa pagitan ng mga malignant at benign nodule sa hanay na 6-20 mm (Fig. 3d).Ang cohort na ito ay may AUC na 0.927, pagtitiyak ng 0.868, at sensitivity ng 0.820 para sa paghula ng malignancy ng mga nodule na may sukat na 6 hanggang 20 mm (Fig. 3e, f).Ipinapakita ng aming mga resulta na maaaring makuha ng classifier ang mga metabolic na pagbabago na dulot ng maagang malignant na pagbabago, anuman ang laki ng nodule.
ad Paghahambing ng mga profile ng PCA sa pagitan ng mga tinukoy na grupo batay sa isang metabolic classifier ng 27 metabolites.CC at BN < 6 mm.b BN < 6 mm kumpara sa BN 6–20 mm.sa LA 6–20 mm kumpara sa LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm at LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC) curve na nagpapakita ng discriminant na performance ng modelo para sa mga nodule na 6–20 mm.f Ang mga halaga ng posibilidad ay kinakalkula batay sa modelo ng logistic regression para sa mga nodule na may sukat na 6–20 mm.Kinakatawan ng gray na tuldok na linya ang pinakamainam na halaga ng cutoff (0.455).Ang mga numero sa itaas ay kumakatawan sa porsyento ng mga kaso na inaasahang para sa Los Angeles.Gumamit ng two-tailed Student's t test.PCA, pangunahing bahagi ng pagsusuri.AUC area sa ilalim ng curve.Ang source data ay ibinibigay sa anyo ng source data file.
Apat na sample (may edad na 44-61 taon) na may magkatulad na laki ng pulmonary nodule (7-9 mm) ay karagdagang pinili upang ilarawan ang pagganap ng iminungkahing modelo ng hula ng malignancy (Larawan 4a, b).Sa paunang screening, ipinakita ang Case 1 bilang solid nodule na may calcification, isang feature na nauugnay sa benignity, samantalang ipinakita naman ang Case 2 bilang isang indeterminate partially solid nodule na walang halatang benign feature.Tatlong pag-ikot ng follow-up na CT scan ay nagpakita na ang mga kasong ito ay nanatiling matatag sa loob ng 4 na taon at samakatuwid ay itinuturing na mga benign nodule (Larawan 4a).Kung ikukumpara sa klinikal na pagsusuri ng mga serial CT scan, ang single-shot na serum metabolite analysis kasama ang kasalukuyang classifier model ay mabilis at tama na natukoy ang mga benign nodule na ito batay sa probabilistic constraints (Talahanayan 1).Ang Figure 4b sa kaso 3 ay nagpapakita ng nodule na may mga palatandaan ng pleural retraction, na kadalasang nauugnay sa malignancy32.Ang kaso 4 ay ipinakita bilang isang hindi tiyak na bahagyang solidong nodule na walang katibayan ng isang benign na dahilan.Ang lahat ng mga kasong ito ay hinuhulaan bilang malignant ayon sa modelo ng classifier (Talahanayan 1).Ang pagtatasa ng lung adenocarcinoma ay ipinakita sa pamamagitan ng histopathological examination pagkatapos ng lung resection surgery (Fig. 4b).Para sa panlabas na hanay ng pagpapatunay, tumpak na hinulaang ng metabolic classifier ang dalawang kaso ng hindi tiyak na mga nodule ng baga na mas malaki kaysa sa 6 mm (Karagdagang Larawan 10).
Mga larawan ng CT ng axial window ng mga baga ng dalawang kaso ng benign nodules.Sa kaso 1, ang CT scan pagkatapos ng 4 na taon ay nagpakita ng isang matatag na solid nodule na may sukat na 7 mm na may calcification sa kanang lower lobe.Sa kaso 2, ang CT scan pagkatapos ng 5 taon ay nagpakita ng isang matatag, bahagyang solidong nodule na may diameter na 7 mm sa kanang itaas na lobe.b Axial window CT na mga larawan ng mga baga at kaukulang pathological na pag-aaral ng dalawang kaso ng stage I adenocarcinoma bago ang resection ng baga.Ang kaso 3 ay nagpakita ng isang nodule na may diameter na 8 mm sa kanang itaas na umbok na may pleural retraction.Ang kaso 4 ay nagpakita ng isang bahagyang solidong ground-glass nodule na may sukat na 9 mm sa kaliwang itaas na lobe.Hematoxylin at eosin (H&E) staining ng resected lung tissue (scale bar = 50 μm) na nagpapakita ng acinar growth pattern ng lung adenocarcinoma.Ang mga arrow ay nagpapahiwatig ng mga nodule na nakita sa mga larawan ng CT.Ang mga larawan ng H&E ay mga kinatawan ng mga larawan ng maramihang (>3) mga mikroskopikong field na sinuri ng pathologist.
Kung sama-sama, ipinapakita ng aming mga resulta ang potensyal na halaga ng mga serum metabolite biomarker sa differential diagnosis ng pulmonary nodules, na maaaring magdulot ng mga hamon kapag sinusuri ang CT screening.
Batay sa isang napatunayan na differential metabolite panel, hinahangad naming kilalanin ang mga biological correlates ng mga pangunahing pagbabago sa metabolic.Ang KEGG pathway enrichment analysis ng MetaboAnalyst ay nakilala ang 6 na karaniwang makabuluhang binagong mga pathway sa pagitan ng dalawang ibinigay na grupo (LA vs. HC at LA vs. BN, inayos p ≤ 0.001, epekto > 0.01).Ang mga pagbabagong ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng mga kaguluhan sa pyruvate metabolism, tryptophan metabolism, niacin at nicotinamide metabolism, glycolysis, TCA cycle, at purine metabolism (Fig. 5a).Pagkatapos ay nagsagawa pa kami ng mga naka-target na metabolomics upang i-verify ang mga pangunahing pagbabago gamit ang ganap na dami.Pagpapasiya ng mga karaniwang metabolite sa karaniwang binagong mga landas sa pamamagitan ng triple quadrupole mass spectrometry (QQQ) gamit ang mga tunay na pamantayan ng metabolite.Ang mga demograpikong katangian ng metabolomics study target sample ay kasama sa Karagdagang Talahanayan 4. Alinsunod sa aming pandaigdigang mga resulta ng metabolomics, kinumpirma ng quantitative analysis na ang hypoxanthine at xanthine, pyruvate, at lactate ay nadagdagan sa LA kumpara sa BN at HC (Fig. 5b, c, p <0.05).Gayunpaman, walang makabuluhang pagkakaiba sa mga metabolite na ito ang natagpuan sa pagitan ng BN at HC.
Ang pagsusuri sa pagpapayaman ng landas ng KEGG ng makabuluhang magkakaibang mga metabolite sa pangkat ng LA kumpara sa mga pangkat ng BN at HC.Ginamit ang two-tailed Globaltest, at ang mga p value ay inayos gamit ang pamamaraang Holm-Bonferroni (naayos p ≤ 0.001 at laki ng epekto > 0.01).b–d Violin plots na nagpapakita ng hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate, at tryptophan na mga antas sa serum HC, BN, at LA na tinutukoy ng LC-MS/MS (n = 70 bawat pangkat).Ang mga puti at itim na tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng median at quartile, ayon sa pagkakabanggit.e Violin plot na nagpapakita ng normalized Log2TPM (transcripts per million) mRNA expression ng SLC7A5 at QPRT sa lung adenocarcinoma (n = 513) kumpara sa normal na tissue ng baga (n = 59) sa LUAD-TCGA dataset.Ang puting kahon ay kumakatawan sa interquartile range, ang pahalang na itim na linya sa gitna ay kumakatawan sa median, at ang patayong itim na linya na umaabot mula sa kahon ay kumakatawan sa 95% confidence interval (CI).f Pearson correlation plot ng SLC7A5 at GAPDH expression sa lung adenocarcinoma (n = 513) at normal na tissue ng baga (n = 59) sa TCGA dataset.Ang kulay abong lugar ay kumakatawan sa 95% CI.r, Pearson correlation coefficient.g Normalized na mga antas ng cellular tryptophan sa A549 na mga cell na inilipat gamit ang nonspecific shRNA control (NC) at shSLC7A5 (Sh1, Sh2) na tinutukoy ng LC-MS/MS.Ang pagtatasa ng istatistika ng limang biologically independent na mga sample sa bawat pangkat ay ipinakita.h Cellular na antas ng NADt (kabuuang NAD, kabilang ang NAD+ at NADH) sa A549 cells (NC) at SLC7A5 knockdown A549 cells (Sh1, Sh2).Ang pagtatasa ng istatistika ng tatlong biologically independent na mga sample sa bawat pangkat ay ipinakita.i Ang Glycolytic na aktibidad ng A549 cells bago at pagkatapos ng SLC7A5 knockdown ay sinusukat ng extracellular acidification rate (ECAR) (n = 4 na biologically independent samples bawat grupo).2-DG,2-deoxy-D-glucose.Ang two-tailed Student's t test ay ginamit sa (b–h).Sa (g–i), ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± SD, ang bawat eksperimento ay isinagawa nang tatlong beses nang nakapag-iisa at ang mga resulta ay magkapareho.Ang source data ay ibinibigay sa anyo ng source data file.
Isinasaalang-alang ang makabuluhang epekto ng binagong metabolismo ng tryptophan sa pangkat ng LA, sinuri din namin ang mga antas ng serum tryptophan sa mga pangkat ng HC, BN, at LA gamit ang QQQ.Natagpuan namin na ang serum tryptophan ay nabawasan sa LA kumpara sa HC o BN (p <0.001, Figure 5d), na naaayon sa mga nakaraang natuklasan na ang nagpapalipat-lipat na mga antas ng tryptophan ay mas mababa sa mga pasyente na may kanser sa baga kaysa sa malusog na mga kontrol mula sa control group33, 34 ,35.Ang isa pang pag-aaral gamit ang PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan ay natagpuan na ang oras ng pagpapanatili ng signal ng tryptophan sa tissue ng kanser sa baga ay makabuluhang nadagdagan kumpara sa mga benign lesyon o normal na tissue36.Ipinagpalagay namin na ang pagbaba sa tryptophan sa LA serum ay maaaring magpakita ng aktibong tryptophan uptake ng mga selula ng kanser sa baga.
Alam din na ang huling produkto ng kynurenine pathway ng tryptophan catabolism ay NAD+37,38, na isang mahalagang substrate para sa reaksyon ng glyceraldehyde-3-phosphate na may 1,3-bisphosphoglycerate sa glycolysis39.Habang ang mga nakaraang pag-aaral ay nakatuon sa papel ng tryptophan catabolism sa immune regulation, hinahangad naming ipaliwanag ang interplay sa pagitan ng tryptophan dysregulation at glycolytic pathway na sinusunod sa kasalukuyang pag-aaral.Ang solute transporter family 7 member 5 (SLC7A5) ay kilala bilang isang tryptophan transporter43,44,45.Ang Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) ay isang enzyme na matatagpuan sa ibaba ng agos ng kynurenine pathway na nagko-convert ng quinolinic acid sa NAMN46.Ang inspeksyon ng LUAD TCGA dataset ay nagsiwalat na ang parehong SLC7A5 at QPRT ay makabuluhang na-upregulated sa tumor tissue kumpara sa normal na tissue (Fig. 5e).Ang pagtaas na ito ay na-obserbahan sa mga yugto I at II pati na rin ang mga yugto III at IV ng baga adenocarcinoma (Karagdagang Larawan 11), na nagpapahiwatig ng mga maagang kaguluhan sa tryptophan metabolism na nauugnay sa tumorigenesis.
Bilang karagdagan, ang LUAD-TCGA dataset ay nagpakita ng isang positibong ugnayan sa pagitan ng SLC7A5 at GAPDH mRNA expression sa mga sample ng pasyente ng cancer (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figure 5f).Sa kaibahan, walang makabuluhang ugnayan ang natagpuan sa pagitan ng naturang mga lagda ng gene sa normal na tissue ng baga (r = 0.25, p = 0.06, Figure 5f).Ang pagbagsak ng SLC7A5 (Karagdagang Larawan 12) sa mga cell ng A549 ay makabuluhang nabawasan ang mga antas ng cellular tryptophan at NAD (H) (Larawan 5g, h), na nagreresulta sa attenuated na aktibidad ng glycolytic na sinusukat ng extracellular acidification rate (ECAR) (Larawan 1).5i).Kaya, batay sa mga pagbabago sa metabolic sa serum at in vitro detection, ipinapalagay namin na ang metabolismo ng tryptophan ay maaaring makagawa ng NAD + sa pamamagitan ng kynurenine pathway at may mahalagang papel sa pagsulong ng glycolysis sa kanser sa baga.
Ipinakita ng mga pag-aaral na ang malaking bilang ng mga hindi tiyak na pulmonary nodules na nakita ng LDCT ay maaaring humantong sa pangangailangan para sa karagdagang pagsusuri tulad ng PET-CT, lung biopsy, at overtreatment dahil sa isang false-positive na diagnosis ng malignancy.31 Gaya ng ipinapakita sa Figure 6, Tinukoy ng aming pag-aaral ang isang panel ng mga serum metabolite na may potensyal na halaga ng diagnostic na maaaring mapabuti ang stratification ng panganib at kasunod na pamamahala ng mga pulmonary nodules na nakita ng CT.
Sinusuri ang mga pulmonary nodules gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) na may mga imaging feature na nagpapahiwatig ng benign o malignant na mga sanhi.Ang hindi tiyak na kinalabasan ng mga nodule ay maaaring humantong sa mga madalas na follow-up na pagbisita, hindi kinakailangang mga interbensyon, at labis na paggamot.Ang pagsasama ng mga serum metabolic classifier na may diagnostic na halaga ay maaaring mapabuti ang pagtatasa ng panganib at kasunod na pamamahala ng mga pulmonary nodules.PET positron emission tomography.
Iminumungkahi ng data mula sa pag-aaral ng US NLST at European NELSON na pag-aaral na ang pag-screen ng mga high-risk group na may low-dose computed tomography (LDCT) ay maaaring mabawasan ang mortality cancer sa baga1,3.Gayunpaman, ang pagtatasa ng panganib at kasunod na klinikal na pamamahala ng malaking bilang ng mga incidental pulmonary nodules na nakita ng LDCT ay nananatiling pinakamahirap.Ang pangunahing layunin ay i-optimize ang tamang pag-uuri ng mga umiiral na protocol na nakabatay sa LDCT sa pamamagitan ng pagsasama ng mga maaasahang biomarker.
Ang ilang mga molekular na biomarker, tulad ng mga metabolite ng dugo, ay natukoy sa pamamagitan ng paghahambing ng kanser sa baga na may malusog na kontrol15,17.Sa kasalukuyang pag-aaral, nakatuon kami sa aplikasyon ng pagsusuri ng serum metabolomics upang makilala sa pagitan ng benign at malignant na pulmonary nodules na hindi sinasadyang nakita ng LDCT.Inihambing namin ang pandaigdigang serum metabolome ng malusog na kontrol (HC), benign lung nodules (BN), at stage I lung adenocarcinoma (LA) na mga sample gamit ang pagsusuri ng UPLC-HRMS.Natagpuan namin na ang HC at BN ay may magkatulad na metabolic profile, samantalang ang LA ay nagpakita ng mga makabuluhang pagbabago kumpara sa HC at BN.Nakilala namin ang dalawang hanay ng mga serum metabolites na naiiba ang LA mula sa HC at BN.
Ang kasalukuyang LDCT-based na identification scheme para sa benign at malignant nodules ay pangunahing nakabatay sa laki, density, morphology at growth rate ng nodules sa paglipas ng panahon30.Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang laki ng mga nodule ay malapit na nauugnay sa posibilidad ng kanser sa baga.Kahit na sa mga pasyente na may mataas na panganib, ang panganib ng malignancy sa mga node na <6 mm ay <1%.Ang panganib ng malignancy para sa mga nodule na may sukat na 6 hanggang 20 mm ay mula 8% hanggang 64%30.Samakatuwid, inirerekomenda ng Fleischner Society ang cutoff diameter na 6 mm para sa regular na CT follow-up.29 Gayunpaman, ang pagtatasa ng panganib at pamamahala ng mga hindi tiyak na pulmonary nodules (IPN) na mas malaki sa 6 mm ay hindi pa naisagawa nang sapat 31 .Ang kasalukuyang pamamahala ng congenital heart disease ay karaniwang batay sa maingat na paghihintay na may madalas na pagsubaybay sa CT.
Batay sa napatunayang metabolome, ipinakita namin sa unang pagkakataon ang overlap ng mga lagda ng metabolismo sa pagitan ng mga malulusog na indibidwal at mga benign nodule <6 mm.Ang pagkakatulad ng biyolohikal ay pare-pareho sa mga nakaraang natuklasan ng CT na ang panganib ng malignancy para sa mga nodule <6 mm ay kasing baba ng para sa mga paksang walang node.30 Dapat tandaan na ang aming mga resulta ay nagpapakita rin na ang mga benign nodule <6 mm at ≥6 mm ay may mataas pagkakapareho sa mga metabolomic na profile, na nagmumungkahi na ang functional na kahulugan ng benign etiology ay pare-pareho anuman ang laki ng nodule.Kaya, ang mga modernong diagnostic serum metabolite panel ay maaaring magbigay ng isang solong assay bilang isang rule-out na pagsubok kapag ang mga nodule ay unang nakita sa CT at potensyal na bawasan ang serial monitoring.Kasabay nito, ang parehong panel ng mga metabolic biomarker ay nakikilala ang mga malignant na nodule na ≥6 mm ang laki mula sa mga benign nodules at nagbigay ng tumpak na mga hula para sa mga IPN na magkatulad na laki at hindi maliwanag na mga tampok na morphological sa mga imahe ng CT.Ang serum metabolism classifier na ito ay mahusay na gumanap sa paghula ng malignancy ng nodules ≥6 mm na may AUC na 0.927.Kung sama-sama, ang aming mga resulta ay nagpapahiwatig na ang mga natatanging serum metabolomic na lagda ay maaaring partikular na sumasalamin sa maagang mga pagbabago sa metabolic na dulot ng tumor at may potensyal na halaga bilang mga prediktor ng panganib, na independiyente sa laki ng nodule.
Kapansin-pansin, ang lung adenocarcinoma (LUAD) at squamous cell carcinoma (LUSC) ay ang mga pangunahing uri ng non-small cell lung cancer (NSCLC).Dahil ang LUSC ay malakas na nauugnay sa paggamit ng tabako47 at ang LUAD ay ang pinakakaraniwang histology ng incidental lung nodules na nakita sa CT screening48, ang aming classifier model ay partikular na binuo para sa stage I na mga sample ng adenocarcinoma.Nakatuon din si Wang at mga kasamahan sa LUAD at natukoy ang siyam na lipid signature gamit ang lipidomics upang makilala ang maagang yugto ng kanser sa baga mula sa mga malulusog na indibidwal17.Sinubukan namin ang kasalukuyang modelo ng classifier sa 16 na kaso ng stage I LUSC at 74 na benign nodules at naobserbahan ang mababang katumpakan ng hula ng LUSC (AUC 0.776), na nagmumungkahi na ang LUAD at LUSC ay maaaring magkaroon ng kanilang sariling mga lagda ng metabolomic.Sa katunayan, ang LUAD at LUSC ay ipinakita na naiiba sa etiology, biological na pinagmulan at genetic aberrations49.Samakatuwid, ang iba pang mga uri ng histology ay dapat isama sa mga modelo ng pagsasanay para sa pagtuklas ng kanser sa baga na nakabatay sa populasyon sa mga programa sa screening.
Dito, natukoy namin ang anim na pinakamadalas na binagong mga landas sa baga adenocarcinoma kumpara sa malusog na mga kontrol at benign nodules.Ang Xanthine at hypoxanthine ay karaniwang mga metabolite ng purine metabolic pathway.Alinsunod sa aming mga resulta, ang mga intermediate na nauugnay sa purine metabolism ay makabuluhang nadagdagan sa serum o mga tisyu ng mga pasyente na may lung adenocarcinoma kumpara sa mga malusog na kontrol o mga pasyente sa preinvasive stage15,50.Ang mataas na antas ng serum xanthine at hypoxanthine ay maaaring magpakita ng anabolismo na kinakailangan ng mabilis na paglaganap ng mga selula ng kanser.Ang dysregulation ng glucose metabolism ay isang kilalang tanda ng cancer metabolism51.Dito, napansin namin ang isang makabuluhang pagtaas sa pyruvate at lactate sa pangkat ng LA kumpara sa pangkat ng HC at BN, na naaayon sa mga nakaraang ulat ng mga abnormalidad ng glycolytic pathway sa mga profile ng serum metabolome ng mga hindi maliit na cell lung cancer (NSCLC) na mga pasyente at malusog na kontrol.pare-pareho ang mga resulta52,53.
Mahalaga, napansin namin ang isang kabaligtaran na ugnayan sa pagitan ng pyruvate at tryptophan metabolism sa suwero ng adenocarcinomas ng baga.Ang mga antas ng serum tryptophan ay nabawasan sa pangkat ng LA kumpara sa pangkat ng HC o BN.Kapansin-pansin, natuklasan ng isang nakaraang malakihang pag-aaral gamit ang isang prospective cohort na ang mababang antas ng nagpapalipat-lipat na tryptophan ay nauugnay sa mas mataas na panganib ng kanser sa baga 54 .Ang tryptophan ay isang mahalagang amino acid na nakukuha natin sa pagkain.Napagpasyahan namin na ang serum tryptophan depletion sa lung adenocarcinoma ay maaaring magpakita ng mabilis na pag-ubos ng metabolite na ito.Kilalang-kilala na ang huling produkto ng tryptophan catabolism sa pamamagitan ng kynurenine pathway ay ang pinagmulan ng de novo NAD+ synthesis.Dahil ang NAD+ ay pangunahing ginawa sa pamamagitan ng salvage pathway, ang kahalagahan ng NAD+ sa tryptophan metabolism sa kalusugan at sakit ay nananatiling matutukoy46.Ang aming pagsusuri sa database ng TCGA ay nagpakita na ang pagpapahayag ng tryptophan transporter solute transporter 7A5 (SLC7A5) ay makabuluhang nadagdagan sa adenocarcinoma ng baga kumpara sa mga normal na kontrol at positibong nakakaugnay sa pagpapahayag ng glycolytic enzyme GAPDH.Ang mga nakaraang pag-aaral ay pangunahing nakatuon sa papel ng tryptophan catabolism sa pagsugpo sa antitumor immune response40,41,42.Dito ipinapakita namin na ang pagsugpo sa tryptophan uptake sa pamamagitan ng pagbagsak ng SLC7A5 sa mga selula ng kanser sa baga ay nagreresulta sa isang kasunod na pagbaba sa mga antas ng cellular NAD at isang kasabay na pagpapahina ng aktibidad ng glycolytic.Sa buod, ang aming pag-aaral ay nagbibigay ng isang biological na batayan para sa mga pagbabago sa serum metabolism na nauugnay sa malignant na pagbabagong-anyo ng adenocarcinoma ng baga.
Ang mga mutasyon ng EGFR ay ang pinakakaraniwang mga mutation ng driver sa mga pasyente na may NSCLC.Sa aming pag-aaral, nalaman namin na ang mga pasyente na may mutation ng EGFR (n = 41) ay may pangkalahatang mga profile ng metabolomic na katulad ng mga pasyente na may wild-type na EGFR (n = 31), kahit na natagpuan namin ang pagbaba ng mga antas ng serum ng ilang mga pasyenteng mutant ng EGFR sa mga pasyente ng acylcarnitine.Ang itinatag na function ng acylcarnitines ay ang transportasyon ng mga acyl group mula sa cytoplasm patungo sa mitochondrial matrix, na humahantong sa oksihenasyon ng mga fatty acid upang makagawa ng enerhiya 55 .Alinsunod sa aming mga natuklasan, ang isang kamakailang pag-aaral ay natukoy din ang magkatulad na mga profile ng metabolome sa pagitan ng EGFR mutant at EGFR wild-type na mga tumor sa pamamagitan ng pagsusuri sa pandaigdigang metabolome ng 102 na mga sample ng tissue ng adenocarcinoma ng baga50.Kapansin-pansin, ang nilalaman ng acylcarnitine ay natagpuan din sa pangkat ng mutant ng EGFR.Samakatuwid, kung ang mga pagbabago sa mga antas ng acylcarnitine ay sumasalamin sa mga pagbabagong metabolic na dulot ng EGFR at ang pinagbabatayan na mga molecular pathway ay maaaring magkaroon ng karagdagang pag-aaral.
Sa konklusyon, ang aming pag-aaral ay nagtatatag ng isang serum metabolic classifier para sa differential diagnosis ng pulmonary nodules at nagmumungkahi ng isang daloy ng trabaho na maaaring mag-optimize ng pagtatasa ng panganib at mapadali ang klinikal na pamamahala batay sa CT scan screening.
Ang pag-aaral na ito ay inaprubahan ng Ethics Committee ng Sun Yat-sen University Cancer Hospital, ng First Affiliated Hospital ng Sun Yat-sen University, at ng Ethics Committee ng Zhengzhou University Cancer Hospital.Sa mga discovery at internal validation group, 174 sera mula sa malulusog na indibidwal at 244 sera mula sa benign nodules ang nakolekta mula sa mga indibidwal na sumasailalim sa taunang medikal na eksaminasyon sa Department of Cancer Control and Prevention, Sun Yat-sen University Cancer Center, at 166 benign nodules.suwero.Ang Stage I lung adenocarcinomas ay nakolekta mula sa Sun Yat-sen University Cancer Center.Sa external validation cohort, mayroong 48 kaso ng benign nodules, 39 na kaso ng stage I lung adenocarcinoma mula sa First Affiliated Hospital ng Sun Yat-sen University, at 24 na kaso ng stage I lung adenocarcinoma mula sa Zhengzhou Cancer Hospital.Nakolekta din ng Sun Yat-sen University Cancer Center ang 16 na kaso ng stage I squamous cell lung cancer upang subukan ang diagnostic na kakayahan ng itinatag na metabolic classifier (ang mga katangian ng pasyente ay ipinapakita sa Karagdagang Talahanayan 5).Ang mga sample mula sa discovery cohort at internal validation cohort ay nakolekta sa pagitan ng Enero 2018 at Mayo 2020. Ang mga sample para sa external validation cohort ay nakolekta sa pagitan ng Agosto 2021 at Oktubre 2022. Para mabawasan ang bias ng kasarian, humigit-kumulang pantay na bilang ng mga kaso ng lalaki at babae ang itinalaga sa bawat isa pangkat.Discovery Team at Internal Review Team.Natukoy ang kasarian ng kalahok batay sa sariling ulat.Nakuha ang may kaalamang pahintulot mula sa lahat ng kalahok at walang ibinigay na kabayaran.Ang mga paksa na may benign nodules ay ang mga may matatag na marka ng CT scan sa 2 hanggang 5 taon sa oras ng pagsusuri, maliban sa 1 kaso mula sa panlabas na sample ng pagpapatunay, na nakolekta bago ang operasyon at nasuri ng histopathology.Maliban sa talamak na brongkitis.Ang mga kaso ng adenocarcinoma sa baga ay nakolekta bago ang pagputol ng baga at nakumpirma ng pathological diagnosis.Ang mga sample ng dugo sa pag-aayuno ay nakolekta sa mga serum separation tubes nang walang anumang anticoagulants.Ang mga sample ng dugo ay na-clotted para sa 1 oras sa temperatura ng silid at pagkatapos ay centrifuge sa 2851 × g para sa 10 minuto sa 4 ° C upang mangolekta ng serum supernatant.Ang mga serum aliquot ay nagyelo sa -80°C hanggang sa pagkuha ng metabolite.Ang Department of Cancer Prevention at Medical Examination ng Sun Yat-sen University Cancer Center ay nangolekta ng isang pool ng serum mula sa 100 malusog na donor, kabilang ang pantay na bilang ng mga lalaki at babae na may edad 40 hanggang 55 taon.Ang pantay na dami ng bawat sample ng donor ay pinaghalo, ang nagresultang pool ay na-aliquoted at nakaimbak sa -80°C.Ang pinaghalong serum ay ginamit bilang sanggunian na materyal para sa kontrol ng kalidad at standardisasyon ng data.
Ang sanggunian na serum at mga sample ng pagsubok ay lasaw at ang mga metabolite ay nakuha gamit ang pinagsamang paraan ng pagkuha (MTBE/methanol/tubig) 56 .Sa madaling sabi, 50 μl ng serum ay hinaluan ng 225 μl ng ice-cold methanol at 750 μl ng ice-cold methyl tert-butyl ether (MTBE).Haluin ang timpla at i-incubate sa yelo sa loob ng 1 oras.Ang mga sample ay pagkatapos ay pinaghalo at vortex na may halong 188 μl ng MS-grade na tubig na naglalaman ng mga panloob na pamantayan (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, at 13C6-isoleucine, na binili mula sa Cambridge Isotope Laboratories).Ang halo ay pagkatapos ay centrifuge sa 15,000 × g para sa 10 min sa 4 ° C, at ang mas mababang bahagi ay inilipat sa dalawang tubo (125 μL bawat isa) para sa pagsusuri ng LC-MS sa positibo at negatibong mga mode.Sa wakas, ang sample ay sumingaw sa pagkatuyo sa isang high-speed vacuum concentrator.
Ang mga pinatuyong metabolite ay na-reconstituted sa 120 μl ng 80% acetonitrile, vortexed para sa 5 min, at centrifuged sa 15,000 × g para sa 10 min sa 4 ° C.Ang mga supernatant ay inilipat sa amber glass vial na may mga microinsert para sa pag-aaral ng metabolomics.Hindi naka-target na pagsusuri ng metabolomics sa isang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) platform.Ang mga metabolite ay pinaghiwalay gamit ang isang Dionex Ultimate 3000 UPLC system at isang ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Sa positive ion mode, ang mga mobile phase ay 95% (A) at 50% acetonitrile (B), bawat isa ay naglalaman ng 10 mmol/L ammonium acetate at 0.1% formic acid.Sa negatibong mode, ang mga mobile phase A at B ay naglalaman ng 95% at 50% acetonitrile, ayon sa pagkakabanggit, ang parehong mga phase ay naglalaman ng 10 mmol/L ammonium acetate, pH = 9. Ang gradient program ay ang mga sumusunod: 0–0.5 min, 2% B;0.5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1–20 min, 2% B. Ang column ay pinananatili sa 40°C at ang sample sa 10°C sa autosampler.Ang daloy ng rate ay 0.3 ml / min, ang dami ng iniksyon ay 3 μl.Ang isang Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) na may electrospray ionization (ESI) source ay pinatakbo sa full scan mode at isinama sa ddMS2 monitoring mode upang mangolekta ng malalaking volume ng data.Ang mga parameter ng MS ay itinakda tulad ng sumusunod: spray boltahe +3.8 kV/- 3.2 kV, capillary temperature 320°C, shielding gas 40 arb, auxiliary gas 10 arb, probe heater temperature 350°C, scanning range 70–1050 m/h, resolusyon.70 000. Nakuha ang datos gamit ang Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Upang masuri ang kalidad ng data, nabuo ang mga sample ng pooled quality control (QC) sa pamamagitan ng pag-alis ng 10 μL aliquot ng supernatant mula sa bawat sample.Anim na quality control sample injection ang nasuri sa simula ng analytical sequence upang masuri ang katatagan ng UPLC-MS system.Ang mga sample ng quality control ay pana-panahong ipinapasok sa batch.Ang lahat ng 11 batch ng mga sample ng serum sa pag-aaral na ito ay nasuri ng LC-MS.Ang mga aliquot ng isang pinaghalong serum pool mula sa 100 malusog na donor ay ginamit bilang reference na materyal sa kani-kanilang mga batch upang subaybayan ang proseso ng pagkuha at ayusin para sa mga batch-to-batch na epekto.Ang hindi naka-target na pagsusuri ng metabolomics ng discovery cohort, internal validation cohort, at external validation cohort ay isinagawa sa Metabolomics Center ng Sun Yat-sen University.Sinuri din ng panlabas na laboratoryo ng Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center ang 40 sample mula sa external cohort upang subukan ang performance ng classifier model.
Pagkatapos ng extraction at reconstitution, sinukat ang absolute quantitation ng serum metabolites gamit ang ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Agilent 6495 triple quadrupole) na may electrospray ionization (ESI) source sa multiple reaction monitoring (MRM) mode.Ang isang ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) ay ginamit upang paghiwalayin ang mga metabolite.Ang mobile phase ay binubuo ng 90% (A) at 5% acetonitrile (B) na may 10 mmol/L ammonium acetate at 0.1% ammonia solution.Ang gradient program ay ang mga sumusunod: 0–1.5 min, 0% B;1.5–6.5 min, 0–15% B;6.5–8 min, 15% B;8–8.5 min, 15%–0% B;8.5–11.5 min, 0%B.Ang column ay pinananatili sa 40 °C at ang sample sa 10 °C sa autosampler.Ang rate ng daloy ay 0.3 mL / min at ang dami ng iniksyon ay 1 μL.Ang mga parameter ng MS ay itinakda bilang mga sumusunod: boltahe ng maliliit na ugat ± 3.5 kV, presyon ng nebulizer 35 psi, daloy ng sheath gas 12 L/min, temperatura ng sheath gas 350°C, temperatura ng pagpapatuyo ng gas 250°C, at daloy ng gas sa pagpapatuyo 14 l/min.Ang mga conversion ng MRM ng tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine at xanthine ay 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 at 151.0–107.9 ayon sa pagkakabanggit.Ang mga datos ay nakolekta gamit ang Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Para sa mga sample ng serum, ang tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, at xanthine ay na-quantified gamit ang mga calibration curves ng standard mixture solutions.Para sa mga sample ng cell, ang nilalaman ng tryptophan ay na-normalize sa panloob na pamantayan at masa ng protina ng cell.
Ang peak extraction (m/z at retention time (RT)) ay isinagawa gamit ang Compound Discovery 3.1 at TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Upang maalis ang mga potensyal na pagkakaiba sa pagitan ng mga batch, ang bawat katangian na peak ng sample ng pagsubok ay hinati sa katangian na peak ng reference na materyal mula sa parehong batch upang makuha ang relatibong kasaganaan.Ang mga kamag-anak na standard deviations ng mga panloob na pamantayan bago at pagkatapos ng standardisasyon ay ipinapakita sa Karagdagang Talahanayan 6. Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng dalawang grupo ay nailalarawan sa pamamagitan ng maling rate ng pagtuklas (FDR<0.05, Wilcoxon sign rank test) at fold change (>1.2 o <0.83).Ang Raw MS data ng mga na-extract na feature at reference na serum-corrected MS data ay ipinapakita sa Karagdagang Data 1 at Karagdagang Data 2, ayon sa pagkakabanggit.Ang peak annotation ay isinagawa batay sa apat na tinukoy na antas ng pagkakakilanlan, kabilang ang mga natukoy na metabolites, putatively annotated compounds, putatively characterized compound classes, at hindi kilalang mga compound 22 .Batay sa mga paghahanap sa database sa Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), ang mga biological compound na may MS/MS na tumutugma sa validated na mga pamantayan o eksaktong tugma na anotasyon sa mzCloud (score > 85) o Chemspider ay napili sa wakas bilang mga intermediate sa pagitan ng differential metabolome.Ang mga peak na anotasyon para sa bawat feature ay kasama sa Karagdagang Data 3. Ginamit ang MetaboAnalyst 5.0 para sa univariate analysis ng sum-normalized na metabolite abundance.Sinuri din ng MetaboAnalyst 5.0 ang pagsusuri sa pagpapayaman ng landas ng KEGG batay sa makabuluhang magkakaibang mga metabolite.Ang pangunahing component analysis (PCA) at partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) ay sinuri gamit ang ropls software package (v.1.26.4) na may stack normalization at autoscaling.Ang pinakamainam na metabolite biomarker na modelo para sa paghula ng nodule malignancy ay nabuo gamit ang binary logistic regression na may hindi bababa sa absolute shrinkage at selection operator (LASSO, R package v.4.1-3).Ang pagganap ng discriminant model sa detection at validation sets ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagtantya ng AUC batay sa ROC analysis ayon sa pROC package (v.1.18.0.).Ang pinakamainam na posibilidad na cutoff ay nakuha batay sa maximum na Youden index ng modelo (sensitivity + specificity - 1).Ang mga sample na may mga value na mas mababa o mas malaki kaysa sa threshold ay mahulaan bilang benign nodules at lung adenocarcinoma, ayon sa pagkakabanggit.
Ang mga cell ng A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) ay pinalaki sa F-12K medium na naglalaman ng 10% FBS.Ang mga short hairpin RNA (shRNA) na sequence na nagta-target sa SLC7A5 at isang nontargeting control (NC) ay ipinasok sa lentiviral vector pLKO.1-puro.Ang mga pagkakasunud-sunod ng antisense ng shSLC7A5 ay ang mga sumusunod: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Ang mga antibodies sa SLC7A5 (#5347) at tubulin (#2148) ay binili mula sa Cell Signaling Technology.Ang mga antibodies sa SLC7A5 at tubulin ay ginamit sa isang pagbabanto ng 1: 1000 para sa pagsusuri ng Western blot.
Sinusukat ng Seahorse XF Glycolytic Stress Test ang mga antas ng extracellular acidification (ECAR).Sa assay, ang glucose, oligomycin A, at 2-DG ay pinangangasiwaan nang sunud-sunod upang subukan ang kapasidad ng cellular glycolytic na sinusukat ng ECAR.
Ang mga cell ng A549 na inilipat gamit ang non-targeting control (NC) at shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ay nilagyan ng magdamag sa 10 cm diameter na mga pinggan.Ang mga cell metabolite ay nakuha na may 1 ml ng malamig na yelo na 80% na may tubig na methanol.Ang mga cell sa solusyon ng methanol ay na-scrap, nakolekta sa isang bagong tubo, at na-centrifuge sa 15,000 × g para sa 15 min sa 4 ° C.Mangolekta ng 800 µl ng supernatant at tuyo gamit ang isang high-speed vacuum concentrator.Ang mga pinatuyong metabolite na pellets ay sinuri para sa mga antas ng tryptophan gamit ang LC-MS/MS tulad ng inilarawan sa itaas.Ang mga antas ng cellular NAD(H) sa A549 cells (NC at shSLC7A5) ay sinusukat gamit ang isang quantitative NAD+/NADH colorimetric kit (#K337, BioVision) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa.Ang mga antas ng protina ay sinusukat para sa bawat sample upang gawing normal ang dami ng mga metabolite.
Walang ginamit na istatistikal na pamamaraan upang paunang matukoy ang laki ng sample.Ang mga nakaraang pag-aaral ng metabolomics na naglalayong pagtuklas ng biomarker15, 18 ay itinuturing na mga benchmark para sa pagtukoy ng laki, at kumpara sa mga ulat na ito, ang aming sample ay sapat.Walang mga sample ang hindi kasama sa cohort ng pag-aaral.Ang mga sample ng serum ay random na itinalaga sa isang grupo ng pagtuklas (306 kaso, 74.6%) at isang panloob na pangkat ng pagpapatunay (104 kaso, 25.4%) para sa hindi naka-target na mga pag-aaral ng metabolomics.Random din kaming pumili ng 70 kaso mula sa bawat pangkat mula sa hanay ng pagtuklas para sa mga naka-target na pag-aaral ng metabolomics.Ang mga investigator ay nabulag sa pagtatalaga ng grupo sa panahon ng pagkolekta at pagsusuri ng data ng LC-MS.Ang mga istatistikal na pagsusuri ng data ng metabolomics at mga eksperimento sa cell ay inilarawan sa kani-kanilang mga seksyon ng Mga Resulta, Mga Alamat ng Figure, at Mga Paraan.Ang dami ng cellular tryptophan, NADT, at glycolytic na aktibidad ay isinagawa nang tatlong beses nang nakapag-iisa na may magkaparehong mga resulta.
Para sa higit pang impormasyon tungkol sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang Natural Portfolio Report Abstract na nauugnay sa artikulong ito.
Ang raw MS data ng mga na-extract na feature at ang normalized na MS data ng reference serum ay ipinapakita sa Karagdagang Data 1 at Karagdagang Data 2, ayon sa pagkakabanggit.Ang mga peak annotation para sa mga differential feature ay ipinakita sa Karagdagang Data 3. Ang LUAD TCGA dataset ay maaaring ma-download mula sa https://portal.gdc.cancer.gov/.Ang input data para sa pag-plot ng graph ay ibinibigay sa source data.Ang source data ay ibinigay para sa artikulong ito.
Pambansang Lung Screening Study Group, atbp. Pagbabawas sa pagkamatay ng kanser sa baga gamit ang low-dose computed tomography.Hilagang Inglatera.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR at Propeta, PC Lung cancer screening gamit ang low-dose helical CT: mga resulta mula sa National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Pagbabawas ng mortality cancer sa baga na may volumetric CT screening sa isang randomized na pagsubok.Hilagang Inglatera.J. Med.382, 503–513 (2020).
Oras ng post: Set-18-2023