Ang differential diagnosis ng mga pulmonary nodule na natukoy sa pamamagitan ng computed tomography (CT) ay nananatiling isang hamon sa klinikal na kasanayan. Dito, aming kinikilala ang pandaigdigang metabolome ng 480 sample ng serum, kabilang ang mga malulusog na kontrol, benign lung nodule, at stage I lung adenocarcinoma. Ang mga adenocarcinoma ay nagpapakita ng mga natatanging metabolomic profile, samantalang ang mga benign nodule at malulusog na indibidwal ay may mataas na pagkakatulad sa mga metabolomic profile. Sa discovery group (n = 306), isang set ng 27 metabolite ang natukoy upang maiba ang pagitan ng benign at malignant nodule. Ang AUC ng discriminant model sa internal validation (n = 104) at external validation (n = 111) na grupo ay 0.915 at 0.945, ayon sa pagkakabanggit. Ang pathway analysis ay nagpakita ng pagtaas ng glycolytic metabolites na nauugnay sa pagbaba ng tryptophan sa lung adenocarcinoma serum kumpara sa benign nodule at malulusog na kontrol, at iminungkahi na ang tryptophan uptake ay nagtataguyod ng glycolysis sa mga selula ng kanser sa baga. Itinatampok ng aming pag-aaral ang halaga ng mga serum metabolite biomarker sa pagtatasa ng panganib ng mga pulmonary nodule na natukoy sa pamamagitan ng CT.
Mahalaga ang maagang pagsusuri upang mapabuti ang mga rate ng kaligtasan ng buhay para sa mga pasyenteng may kanser. Ipinakita ng mga resulta mula sa US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) at ng European NELSON Study na ang screening na may low-dose computed tomography (LDCT) ay maaaring makabuluhang bawasan ang dami ng namamatay mula sa kanser sa baga sa mga grupong may mataas na panganib1,2,3. Simula ng malawakang paggamit ng LDCT para sa screening ng kanser sa baga, ang insidente ng mga incidental radiographic findings ng mga asymptomatic pulmonary nodules ay patuloy na tumataas4. Ang mga pulmonary nodules ay binibigyang kahulugan bilang focal opacities na hanggang 3 cm ang diyametro5. Nahaharap kami sa mga kahirapan sa pagtatasa ng posibilidad ng malignancy at pagharap sa malaking bilang ng mga pulmonary nodules na aksidenteng natukoy sa LDCT. Ang mga limitasyon ng CT ay maaaring humantong sa madalas na mga follow-up na pagsusuri at mga false-positive na resulta, na humahantong sa hindi kinakailangang interbensyon at labis na paggamot6. Samakatuwid, may pangangailangang bumuo ng maaasahan at kapaki-pakinabang na mga biomarker upang matukoy nang tama ang kanser sa baga sa mga unang yugto at maiba ang karamihan sa mga benign nodules sa unang pagtuklas7.
Ang komprehensibong pagsusuring molekular ng dugo (serum, plasma, peripheral blood mononuclear cells), kabilang ang genomics, proteomics o DNA methylation8,9,10, ay humantong sa lumalaking interes sa pagtuklas ng mga diagnostic biomarker para sa kanser sa baga. Samantala, sinusukat ng mga pamamaraang metabolomics ang mga cellular end product na naiimpluwensyahan ng mga endogenous at exogenous na aksyon at samakatuwid ay inilalapat upang mahulaan ang pagsisimula at kinalabasan ng sakit. Ang Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) ay isang malawakang ginagamit na pamamaraan para sa mga pag-aaral ng metabolomics dahil sa mataas na sensitivity at malaking dynamic range nito, na maaaring masakop ang mga metabolite na may iba't ibang physicochemical properties11,12,13. Bagama't ginamit ang pandaigdigang pagsusuring metabolomic ng plasma/serum upang matukoy ang mga biomarker na nauugnay sa diagnosis ng kanser sa baga14,15,16,17 at bisa ng paggamot,18 ang mga serum metabolite classifier upang makilala ang pagitan ng benign at malignant na mga nodule sa baga ay nananatiling pinag-aaralan pa. -malawakang pananaliksik.
Ang adenocarcinoma at squamous cell carcinoma ang dalawang pangunahing subtype ng non-small cell lung cancer (NSCLC). Ipinapahiwatig ng iba't ibang CT screening test na ang adenocarcinoma ang pinakakaraniwang histological na uri ng kanser sa baga1,19,20,21. Sa pag-aaral na ito, gumamit kami ng ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) upang magsagawa ng metabolomics analysis sa kabuuang 695 serum sample, kabilang ang mga malulusog na kontrol, benign pulmonary nodules, at CT-detected ≤3 cm. Screening para sa Stage I lung adenocarcinoma. Natukoy namin ang isang panel ng mga serum metabolite na nagpapakilala sa lung adenocarcinoma mula sa benign nodules at malulusog na kontrol. Ipinakita ng pathway enrichment analysis na ang abnormal na tryptophan at glucose metabolism ay karaniwang mga pagbabago sa lung adenocarcinoma kumpara sa benign nodules at malulusog na kontrol. Panghuli, itinatag at napatunayan namin ang isang serum metabolic classifier na may mataas na specificity at sensitivity upang makilala ang pagitan ng malignant at benign pulmonary nodules na natukoy ng LDCT, na maaaring makatulong sa maagang differential diagnosis at risk assessment.
Sa kasalukuyang pag-aaral, ang mga sample ng serum na magkapareho ang kasarian at edad ay kinolekta nang retrospektibo mula sa 174 na malulusog na kontrol, 292 pasyente na may benign pulmonary nodules, at 229 na pasyente na may stage I lung adenocarcinoma. Ang mga demograpikong katangian ng 695 na paksa ay ipinapakita sa Supplementary Table 1.
Gaya ng ipinapakita sa Figure 1a, isang kabuuang 480 sample ng serum, kabilang ang 174 na healthy control (HC), 170 benign nodules (BN), at 136 na stage I lung adenocarcinoma (LA) samples, ang nakolekta sa Sun Yat-sen University Cancer Center. Discovery cohort para sa untargeted metabolomic profiling gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS). Gaya ng ipinapakita sa Supplementary Figure 1, ang mga differential metabolite sa pagitan ng LA at HC, LA at BN ay natukoy upang magtatag ng isang classification model at higit pang tuklasin ang differential pathway analysis. 104 na sample na nakolekta ng Sun Yat-sen University Cancer Center at 111 sample na nakolekta ng dalawa pang ospital ay isinailalim sa internal at external validation, ayon sa pagkakabanggit.
a Populasyon ng pag-aaral sa discovery cohort na sumailalim sa global serum metabolomics analysis gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS). b Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) ng kabuuang metabolome ng 480 serum samples mula sa study cohort, kabilang ang mga malulusog na kontrol (HC, n = 174), benign nodules (BN, n = 170), at stage I lung adenocarcinoma (Los Angeles, n = 136). +ESI, positive electrospray ionization mode, -ESI, negative electrospray ionization mode. c–e Ang mga metabolite na may makabuluhang magkakaibang kasaganaan sa dalawang ibinigay na grupo (two-tailed Wilcoxon signed rank test, false discovery rate adjusted p value, FDR <0.05) ay ipinapakita sa pula (fold change > 1.2) at asul (fold change < 0.83). ) na ipinapakita sa volcano graphic. f Heat map ng hierarchical clustering na nagpapakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa bilang ng mga annotated metabolite sa pagitan ng LA at BN. Ang pinagmulang datos ay ibinibigay sa anyo ng mga source data file.
Ang kabuuang serum metabolome ng 174 HC, 170 BN at 136 LA sa grupong natuklasan ay sinuri gamit ang pagsusuri ng UPLC-HRMS. Una naming ipinakita na ang mga sample ng quality control (QC) ay mahigpit na nagtitipon sa gitna ng isang unsupervised principal component analysis (PCA) model, na nagpapatunay sa katatagan ng pagganap ng kasalukuyang pag-aaral (Karagdagang Larawan 2).
Gaya ng ipinapakita sa partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) sa Figure 1 b, natuklasan namin na may malinaw na pagkakaiba sa pagitan ng LA at BN, LA at HC sa positibo (+ESI) at negatibong (−ESI) electrospray ionization modes. Gayunpaman, walang natagpuang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng BN at HC sa mga kondisyon ng +ESI at -ESI.
Nakakita kami ng 382 na katangiang pagkakaiba sa pagitan ng LA at HC, 231 na katangiang pagkakaiba sa pagitan ng LA at BN, at 95 na katangiang pagkakaiba sa pagitan ng BN at HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0.05 at multiple change >1.2 o <0.83) (Figure .1c-e). Ang mga peak ay karagdagang nilagyan ng anotasyon (Karagdagang Datos 3) laban sa isang database (mzCloud/HMDB/Chemspider library) ayon sa m/z value, retention time at fragmentation mass spectrum search (mga detalyeng inilarawan sa seksyon ng Mga Paraan) 22. Panghuli, 33 at 38 na may anotasyong metabolite na may makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ang natukoy para sa LA laban sa BN (Figure 1f at Supplementary Table 2) at LA laban sa HC (Supplementary Figure 3 at Supplementary Table 2), ayon sa pagkakabanggit. Sa kabaligtaran, 3 metabolite lamang na may makabuluhang pagkakaiba sa kasaganaan ang natukoy sa BN at HC (Supplementary Table 2), na naaayon sa overlap sa pagitan ng BN at HC sa PLS-DA. Ang mga differential metabolite na ito ay sumasaklaw sa malawak na hanay ng mga biochemical (Karagdagang Larawan 4). Kung pagsasama-samahin, ang mga resultang ito ay nagpapakita ng mga makabuluhang pagbabago sa serum metabolome na sumasalamin sa malignant transformation ng early-stage na kanser sa baga kumpara sa benign lung nodules o malulusog na indibidwal. Samantala, ang pagkakatulad ng serum metabolome ng BN at HC ay nagmumungkahi na ang mga benign pulmonary nodules ay maaaring magbahagi ng maraming biological na katangian sa malulusog na indibidwal. Dahil ang mga mutasyon ng epidermal growth factor receptor (EGFR) gene ay karaniwan sa lung adenocarcinoma subtype 23, sinikap naming matukoy ang epekto ng mga driver mutations sa serum metabolome. Pagkatapos ay sinuri namin ang pangkalahatang metabolomic profile ng 72 kaso na may EGFR status sa lung adenocarcinoma group. Kapansin-pansin, nakakita kami ng mga maihahambing na profile sa pagitan ng mga pasyenteng may EGFR mutant (n = 41) at mga pasyenteng may EGFR wild-type (n = 31) sa PCA analysis (Karagdagang Larawan 5a). Gayunpaman, natukoy namin ang 7 metabolite na ang kasaganaan ay makabuluhang nabago sa mga pasyenteng may EGFR mutation kumpara sa mga pasyenteng may wild-type EGFR (t test, p < 0.05 at fold change > 1.2 o < 0.83) (Karagdagang Larawan 5b). Ang karamihan sa mga metabolite na ito (5 sa 7) ay acylcarnitines, na gumaganap ng mahalagang papel sa mga pathway ng oksihenasyon ng fatty acid.
Gaya ng inilalarawan sa daloy ng trabaho na ipinapakita sa Figure 2a, ang mga biomarker para sa klasipikasyon ng nodule ay nakuha gamit ang mga least absolute shrinkage operator at pagpili batay sa 33 differential metabolites na natukoy sa LA (n = 136) at BN (n = 170). Pinakamahusay na kombinasyon ng mga variable (LASSO) – binary logistic regression model. Ginamit ang sampung beses na cross-validation upang subukan ang pagiging maaasahan ng modelo. Ang pagpili ng variable at regularization ng parameter ay inaayos sa pamamagitan ng isang likelihood maximization penalty na may parameter na λ24. Ang global metabolomics analysis ay isinagawa nang hiwalay sa internal validation (n = 104) at external validation (n = 111) na mga grupo upang subukan ang pagganap ng klasipikasyon ng discriminant model. Bilang resulta, 27 metabolites sa discovery set ang natukoy bilang pinakamahusay na discriminant model na may pinakamalaking mean AUC value (Fig. 2b), kung saan 9 ang may tumaas na aktibidad at 18 ang may nabawasang aktibidad sa LA kumpara sa BN (Fig. 2c).
Daloy ng trabaho para sa pagbuo ng isang pulmonary nodule classifier, kabilang ang pagpili ng pinakamahusay na panel ng mga serum metabolite sa discovery set gamit ang isang binary logistic regression model sa pamamagitan ng sampung-tiklop na cross-validation at pagsusuri ng predictive performance sa mga internal at external validation sets. b Mga istatistika ng cross-validation ng LASSO regression model para sa metabolic biomarker selection. Ang mga numerong ibinigay sa itaas ay kumakatawan sa average na bilang ng mga biomarker na napili sa isang ibinigay na λ. Ang pulang tuldok-tuldok na linya ay kumakatawan sa average na halaga ng AUC sa kaukulang lambda. Ang mga gray error bar ay kumakatawan sa minimum at maximum na mga halaga ng AUC. Ang tuldok-tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng pinakamahusay na modelo na may 27 napiling biomarker. AUC, area sa ilalim ng receiver operating characteristic (ROC) curve. c Mga pagbabago sa tiklop ng 27 napiling metabolite sa LA group kumpara sa BN group sa discovery group. Pulang kolum – activation. Ang asul na kolum ay isang pagbaba. d–f Mga kurba ng receiver operating characteristic (ROC) na nagpapakita ng lakas ng discriminant model batay sa 27 kombinasyon ng metabolite sa discovery, internal, at external validation sets. Ang source data ay ibinibigay sa anyo ng mga source data file.
Isang modelo ng prediksyon ang nilikha batay sa mga weighted regression coefficients ng 27 metabolite na ito (Karagdagang Talahanayan 3). Ang pagsusuri ng ROC batay sa 27 metabolite na ito ay nagbunga ng halaga ng area under the curve (AUC) na 0.933, ang sensitivity ng discovery group ay 0.868, at ang specificity ay 0.859 (Larawan 2d). Samantala, sa 38 annotated differential metabolites sa pagitan ng LA at HC, isang set ng 16 na metabolite ang nakamit ang AUC na 0.902 na may sensitivity na 0.801 at specificity na 0.856 sa pag-diskrimina ng LA mula sa HC (Karagdagang Larawan 6a-c). Ang mga halaga ng AUC batay sa iba't ibang fold change thresholds para sa mga differential metabolite ay inihambing din. Natuklasan namin na ang classification model ay pinakamahusay na gumanap sa pag-diskrimina sa pagitan ng LA at BN (HC) nang ang antas ng fold change ay nakatakda sa 1.2 laban sa 1.5 o 2.0 (Karagdagang Larawan 7a,b). Ang modelo ng klasipikasyon, batay sa 27 grupo ng metabolite, ay higit pang napatunayan sa mga internal at external cohort. Ang AUC ay 0.915 (sensitivity 0.867, specificity 0.811) para sa internal validation at 0.945 (sensitivity 0.810, specificity 0.979) para sa external validation (Fig. 2e, f). Upang masuri ang interlaboratory efficiency, 40 sample mula sa external cohort ang sinuri sa isang external laboratory gaya ng inilarawan sa seksyon ng Methods. Ang katumpakan ng klasipikasyon ay nakamit ang AUC na 0.925 (Karagdagang Larawan 8). Dahil ang lung squamous cell carcinoma (LUSC) ang pangalawang pinakakaraniwang subtype ng non-small cell lung cancer (NSCLC) pagkatapos ng lung adenocarcinoma (LUAD), sinubukan din namin ang napatunayang potensyal na utility ng mga metabolic profile. BN at 16 na kaso ng LUSC. Ang AUC ng diskriminasyon sa pagitan ng LUSC at BN ay 0.776 (Karagdagang Larawan 9), na nagpapahiwatig ng mas mahinang kakayahan kumpara sa diskriminasyon sa pagitan ng LUAD at BN.
Ipinakita ng mga pag-aaral na ang laki ng mga nodule sa mga CT image ay may positibong kaugnayan sa posibilidad ng kanser at nananatiling pangunahing determinant ng paggamot sa nodule25,26,27. Ang pagsusuri ng datos mula sa malaking cohort ng NELSON screening study ay nagpakita na ang panganib ng kanser sa mga paksang may mga node na <5 mm ay katulad pa nga ng sa mga paksang walang mga node28. Samakatuwid, ang minimum na laki na nangangailangan ng regular na pagsubaybay sa CT ay 5 mm, gaya ng inirerekomenda ng British Thoracic Society (BTS), at 6 mm, gaya ng inirerekomenda ng Fleischner Society29. Gayunpaman, ang mga nodule na mas malaki sa 6 mm at walang halatang benign features, na tinatawag na indeterminate pulmonary nodules (IPN), ay nananatiling isang malaking hamon sa pagsusuri at pamamahala sa klinikal na kasanayan30,31. Susunod naming sinuri kung ang laki ng nodule ay nakaimpluwensya sa mga metabolomic signature gamit ang mga pooled sample mula sa mga discovery at internal validation cohort. Sa pagtuon sa 27 validated biomarkers, una naming inihambing ang mga PCA profile ng HC at BN sub-6 mm metabolomes. Natuklasan namin na karamihan sa mga data point para sa HC at BN ay nag-overlap, na nagpapakita na ang mga antas ng serum metabolite ay magkatulad sa parehong grupo (Fig. 3a). Ang mga feature map sa iba't ibang saklaw ng laki ay nanatiling napanatili sa BN at LA (Fig. 3b, c), samantalang isang paghihiwalay ang naobserbahan sa pagitan ng malignant at benign nodules sa saklaw na 6-20 mm (Fig. 3d). Ang cohort na ito ay mayroong AUC na 0.927, specificity na 0.868, at sensitivity na 0.820 para sa paghula ng malignancy ng mga nodules na may sukat na 6 hanggang 20 mm (Fig. 3e, f). Ipinapakita ng aming mga resulta na maaaring makuha ng classifier ang mga pagbabago sa metabolismo na dulot ng maagang malignant transformation, anuman ang laki ng nodule.
ad Paghahambing ng mga profile ng PCA sa pagitan ng mga tinukoy na grupo batay sa isang metabolic classifier ng 27 metabolite. CC at BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. sa LA 6–20 mm kumpara sa LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm at LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC) curve na nagpapakita ng discriminant model performance para sa mga nodule na 6–20 mm. f Ang mga halaga ng probabilidad ay kinalkula batay sa logistic regression model para sa mga nodule na may sukat na 6–20 mm. Ang kulay abong tuldok-tuldok na linya ay kumakatawan sa pinakamainam na cutoff value (0.455). Ang mga numero sa itaas ay kumakatawan sa porsyento ng mga kaso na inaasahang para sa Los Angeles. Gumamit ng two-tailed Student's t test. PCA, pagsusuri ng pangunahing bahagi. AUC area sa ilalim ng kurba. Ang pinagmulang datos ay ibinibigay sa anyo ng mga file ng pinagmulang datos.
Apat na sample (may edad na 44–61 taon) na may magkakatulad na laki ng pulmonary nodule (7–9 mm) ang napili pa upang ilarawan ang pagganap ng iminungkahing modelo ng prediksyon ng malignancy (Fig. 4a, b). Sa unang screening, ang Case 1 ay nagpakita bilang isang solidong nodule na may calcification, isang katangiang nauugnay sa benignity, samantalang ang Case 2 ay nagpakita bilang isang indeterminate partially solid nodule na walang halatang benign features. Tatlong round ng follow-up CT scan ang nagpakita na ang mga kasong ito ay nanatiling matatag sa loob ng 4 na taong panahon at samakatuwid ay itinuturing na benign nodules (Fig. 4a). Kung ikukumpara sa klinikal na pagsusuri ng mga serial CT scan, ang single-shot serum metabolite analysis gamit ang kasalukuyang classifier model ay mabilis at wastong natukoy ang mga benign nodules na ito batay sa mga probabilistic constraints (Table 1). Ang Figure 4b sa case 3 ay nagpapakita ng isang nodule na may mga palatandaan ng pleural retraction, na kadalasang nauugnay sa malignancy32. Ang Case 4 ay nagpakita bilang isang indeterminate partially solid nodule na walang ebidensya ng isang benign na sanhi. Ang lahat ng mga kasong ito ay hinulaang malignant ayon sa classifier model (Talahanayan 1). Ang pagtatasa ng lung adenocarcinoma ay ipinakita sa pamamagitan ng histopathological examination pagkatapos ng lung resection surgery (Fig. 4b). Para sa external validation set, tumpak na hinulaan ng metabolic classifier ang dalawang kaso ng indeterminate lung nodules na mas malaki sa 6 mm (Karagdagang Larawan 10).
Mga CT image ng axial window ng baga ng dalawang kaso ng benign nodules. Sa kaso 1, ang CT scan pagkatapos ng 4 na taon ay nagpakita ng isang matatag at solidong nodule na may sukat na 7 mm na may calcification sa kanang ibabang lobe. Sa kaso 2, ang CT scan pagkatapos ng 5 taon ay nagpakita ng isang matatag, bahagyang solidong nodule na may diameter na 7 mm sa kanang itaas na lobe. b Axial window Mga CT image ng baga at mga kaukulang pathological studies ng dalawang kaso ng stage I adenocarcinoma bago ang lung resection. Ang Case 3 ay nagpakita ng isang nodule na may diameter na 8 mm sa kanang itaas na lobe na may pleural retraction. Ang Case 4 ay nagpakita ng isang bahagyang solidong ground-glass nodule na may sukat na 9 mm sa kaliwang itaas na lobe. Hematoxylin at eosin (H&E) staining ng tinanggal na tissue ng baga (scale bar = 50 μm) na nagpapakita ng acinar growth pattern ng lung adenocarcinoma. Ang mga arrow ay nagpapahiwatig ng mga nodule na nakita sa mga CT image. Ang mga H&E image ay mga representatibong larawan ng maramihang (>3) microscopic fields na sinuri ng pathologist.
Kung pagsasama-samahin, ipinapakita ng aming mga resulta ang potensyal na halaga ng mga serum metabolite biomarker sa differential diagnosis ng mga pulmonary nodule, na maaaring magdulot ng mga hamon kapag sinusuri ang CT screening.
Batay sa isang napatunayang differential metabolite panel, hinangad naming tukuyin ang mga biological correlate ng mga pangunahing pagbabago sa metabolismo. Ang pagsusuri ng pagpapayaman ng pathway ng KEGG ng MetaboAnalyst ay nakatukoy ng 6 na karaniwang makabuluhang binagong pathway sa pagitan ng dalawang ibinigay na grupo (LA vs. HC at LA vs. BN, naayos na p ≤ 0.001, epekto > 0.01). Ang mga pagbabagong ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng mga kaguluhan sa metabolismo ng pyruvate, metabolismo ng tryptophan, metabolismo ng niacin at nicotinamide, glycolysis, ang TCA cycle, at metabolismo ng purine (Fig. 5a). Pagkatapos ay nagsagawa pa kami ng mga naka-target na metabolomics upang mapatunayan ang mga pangunahing pagbabago gamit ang absolute quantification. Pagtukoy ng mga karaniwang metabolite sa mga karaniwang binagong pathway sa pamamagitan ng triple quadrupole mass spectrometry (QQQ) gamit ang mga tunay na pamantayan ng metabolite. Ang mga katangiang demograpiko ng target na sample ng pag-aaral ng metabolomics ay kasama sa Supplementary Table 4. Alinsunod sa aming pandaigdigang resulta ng metabolomics, kinumpirma ng quantitative analysis na ang hypoxanthine at xanthine, pyruvate, at lactate ay tumaas sa LA kumpara sa BN at HC (Fig. 5b, c, p <0.05). Gayunpaman, walang natagpuang makabuluhang pagkakaiba sa mga metabolite na ito sa pagitan ng BN at HC.
Pagsusuri ng pagpapayaman ng pathway ng KEGG ng mga metabolite na may makabuluhang pagkakaiba sa grupo ng LA kumpara sa mga grupo ng BN at HC. Ginamit ang two-tailed Globaltest, at ang mga p value ay inayos gamit ang Holm-Bonferroni method (inayos na p ≤ 0.001 at effect size > 0.01). b–d Mga plot ng Violin na nagpapakita ng mga antas ng hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate, at tryptophan sa serum HC, BN, at LA na tinutukoy ng LC-MS/MS (n = 70 bawat grupo). Ang mga puti at itim na tuldok-tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng median at quartile, ayon sa pagkakabanggit. e Plot ng Violin na nagpapakita ng normalized na Log2TPM (transcripts per million) mRNA expression ng SLC7A5 at QPRT sa lung adenocarcinoma (n = 513) kumpara sa normal na tissue ng baga (n = 59) sa LUAD-TCGA dataset. Ang puting kahon ay kumakatawan sa interquartile range, ang pahalang na itim na linya sa gitna ay kumakatawan sa median, at ang patayong itim na linya na nagmumula sa kahon ay kumakatawan sa 95% confidence interval (CI). f Pearson correlation plot ng SLC7A5 at GAPDH expression sa lung adenocarcinoma (n = 513) at normal na tissue sa baga (n = 59) sa TCGA dataset. Ang gray area ay kumakatawan sa 95% CI. r, Pearson correlation coefficient. g Normalized cellular tryptophan levels sa A549 cells na na-transfect gamit ang nonspecific shRNA control (NC) at shSLC7A5 (Sh1, Sh2) na tinukoy ng LC-MS/MS. Ipinapakita ang statistical analysis ng limang biologically independent samples sa bawat grupo. h Cellular levels ng NADt (kabuuang NAD, kabilang ang NAD+ at NADH) sa A549 cells (NC) at SLC7A5 knockdown A549 cells (Sh1, Sh2). Ipinapakita ang statistical analysis ng tatlong biologically independent samples sa bawat grupo. Ang aktibidad na glycolytic ng mga selula ng A549 bago at pagkatapos ng SLC7A5 knockdown ay sinukat gamit ang extracellular acidification rate (ECAR) (n = 4 na biologically independent na sample bawat grupo). 2-DG,2-deoxy-D-glucose. Ginamit ang two-tailed Student's t test sa (b–h). Sa (g–i), ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± SD, ang bawat eksperimento ay isinagawa nang tatlong beses nang magkahiwalay at ang mga resulta ay magkatulad. Ang pinagmulang datos ay ibinibigay sa anyo ng mga source data file.
Kung isasaalang-alang ang malaking epekto ng binagong metabolismo ng tryptophan sa grupong LA, sinuri rin namin ang mga antas ng serum tryptophan sa mga grupong HC, BN, at LA gamit ang QQQ. Natuklasan namin na ang serum tryptophan ay nabawasan sa LA kumpara sa HC o BN (p < 0.001, Figure 5d), na naaayon sa mga nakaraang natuklasan na ang mga antas ng tryptophan sa sirkulasyon ay mas mababa sa mga pasyenteng may kanser sa baga kaysa sa malulusog na kontrol mula sa control group33,34,35. Isa pang pag-aaral gamit ang PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan ang natuklasan na ang oras ng pagpapanatili ng signal ng tryptophan sa tisyu ng kanser sa baga ay tumaas nang malaki kumpara sa mga benign lesion o normal na tisyu36. Ipinapalagay namin na ang pagbaba ng tryptophan sa serum ng LA ay maaaring sumasalamin sa aktibong pagsipsip ng tryptophan ng mga selula ng kanser sa baga.
Alam din na ang huling produkto ng kynurenine pathway ng tryptophan catabolism ay NAD+37,38, na isang mahalagang substrate para sa reaksyon ng glyceraldehyde-3-phosphate sa 1,3-bisphosphoglycerate sa glycolysis39. Bagama't ang mga nakaraang pag-aaral ay nakatuon sa papel ng tryptophan catabolism sa immune regulation, sinikap naming linawin ang interaksyon sa pagitan ng tryptophan dysregulation at glycolytic pathways na naobserbahan sa kasalukuyang pag-aaral. Ang solute transporter family 7 member 5 (SLC7A5) ay kilala bilang isang tryptophan transporter43,44,45. Ang Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) ay isang enzyme na matatagpuan sa ibaba ng agos ng kynurenine pathway na nagko-convert ng quinolinic acid sa NAMN46. Ang inspeksyon ng LUAD TCGA dataset ay nagsiwalat na ang parehong SLC7A5 at QPRT ay makabuluhang tumaas sa tumor tissue kumpara sa normal na tissue (Fig. 5e). Ang pagtaas na ito ay naobserbahan sa mga yugto I at II pati na rin sa mga yugto III at IV ng adenocarcinoma sa baga (Karagdagang Larawan 11), na nagpapahiwatig ng mga maagang kaguluhan sa metabolismo ng tryptophan na nauugnay sa tumorigenesis.
Bukod pa rito, ang dataset ng LUAD-TCGA ay nagpakita ng positibong ugnayan sa pagitan ng ekspresyon ng SLC7A5 at GAPDH mRNA sa mga sample ng pasyenteng may kanser (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figure 5f). Sa kabaligtaran, walang natagpuang makabuluhang ugnayan sa pagitan ng mga naturang gene signature sa normal na tisyu ng baga (r = 0.25, p = 0.06, Figure 5f). Ang pagbagsak ng SLC7A5 (Karagdagang Larawan 12) sa mga selula ng A549 ay makabuluhang nagpababa sa mga antas ng cellular tryptophan at NAD(H) (Figure 5g,h), na nagresulta sa pinahinang aktibidad ng glycolytic na sinusukat ng extracellular acidification rate (ECAR) (Figure 1). 5i). Kaya, batay sa mga pagbabago sa metabolismo sa serum at in vitro detection, ipinapalagay namin na ang metabolismo ng tryptophan ay maaaring makagawa ng NAD+ sa pamamagitan ng kynurenine pathway at gumanap ng mahalagang papel sa pagtataguyod ng glycolysis sa kanser sa baga.
Ipinakita ng mga pag-aaral na ang malaking bilang ng mga indeterminate pulmonary nodule na natukoy ng LDCT ay maaaring humantong sa pangangailangan para sa karagdagang pagsusuri tulad ng PET-CT, lung biopsy, at labis na paggamot dahil sa isang false-positive diagnosis ng malignancy.31 Gaya ng ipinapakita sa Figure 6, natukoy ng aming pag-aaral ang isang panel ng mga serum metabolite na may potensyal na diagnostic value na maaaring mapabuti ang risk stratification at kasunod na pamamahala ng mga pulmonary nodule na natukoy ng CT.
Ang mga pulmonary nodule ay sinusuri gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) na may mga katangiang imaging na nagmumungkahi ng mga benign o malignant na sanhi. Ang hindi tiyak na resulta ng mga nodule ay maaaring humantong sa madalas na mga follow-up na pagbisita, mga hindi kinakailangang interbensyon, at labis na paggamot. Ang pagsasama ng mga serum metabolic classifier na may diagnostic value ay maaaring mapabuti ang pagtatasa ng panganib at kasunod na pamamahala ng mga pulmonary nodule. PET positron emission tomography.
Ang datos mula sa pag-aaral ng NLST sa US at ng pag-aaral ng NELSON sa Europa ay nagmumungkahi na ang screening sa mga grupong may mataas na panganib gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) ay maaaring makabawas sa mortalidad dahil sa kanser sa baga1,3. Gayunpaman, ang pagtatasa ng panganib at kasunod na klinikal na pamamahala ng malaking bilang ng mga incidental pulmonary nodule na natukoy ng LDCT ay nananatiling pinakamahirap. Ang pangunahing layunin ay i-optimize ang tamang klasipikasyon ng mga umiiral na protocol na nakabatay sa LDCT sa pamamagitan ng pagsasama ng mga maaasahang biomarker.
Ang ilang molekular na biomarker, tulad ng mga metabolite ng dugo, ay natukoy sa pamamagitan ng paghahambing ng kanser sa baga sa malulusog na kontrol15,17. Sa kasalukuyang pag-aaral, nagtuon kami sa aplikasyon ng pagsusuri ng serum metabolomics upang makilala ang pagkakaiba sa pagitan ng benign at malignant na mga pulmonary nodule na hindi sinasadyang natukoy ng LDCT. Inihambing namin ang pandaigdigang serum metabolome ng malulusog na kontrol (HC), benign lung nodules (BN), at stage I lung adenocarcinoma (LA) na mga sample gamit ang pagsusuri ng UPLC-HRMS. Natuklasan namin na ang HC at BN ay may magkatulad na metabolic profile, samantalang ang LA ay nagpakita ng mga makabuluhang pagbabago kumpara sa HC at BN. Natukoy namin ang dalawang set ng mga serum metabolite na nagpapaiba sa LA mula sa HC at BN.
Ang kasalukuyang pamamaraan ng pagkilala batay sa LDCT para sa mga benign at malignant na nodule ay pangunahing nakabatay sa laki, densidad, morpolohiya at bilis ng paglaki ng mga nodule sa paglipas ng panahon30. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang laki ng mga nodule ay malapit na nauugnay sa posibilidad ng kanser sa baga. Kahit sa mga pasyenteng may mataas na panganib, ang panganib ng malignancy sa mga node na <6 mm ay <1%. Ang panganib ng malignancy para sa mga nodule na may sukat na 6 hanggang 20 mm ay mula 8% hanggang 64%. Samakatuwid, inirerekomenda ng Fleischner Society ang cutoff diameter na 6 mm para sa regular na CT follow-up.29 Gayunpaman, ang pagtatasa ng panganib at pamamahala ng mga indeterminate pulmonary nodules (IPN) na mas malaki sa 6 mm ay hindi pa sapat na naisagawa 31. Ang kasalukuyang pamamahala ng congenital heart disease ay karaniwang nakabatay sa maingat na paghihintay na may madalas na pagsubaybay sa CT.
Batay sa napatunayang metabolome, ipinakita namin sa unang pagkakataon ang pagsasanib ng mga metabolomic signature sa pagitan ng mga malulusog na indibidwal at mga benign nodule na <6 mm. Ang biyolohikal na pagkakatulad ay naaayon sa mga nakaraang natuklasan sa CT na ang panganib ng malignancy para sa mga nodule na <6 mm ay kasingbaba ng para sa mga paksang walang node.30 Dapat tandaan na ipinapakita rin ng aming mga resulta na ang mga benign nodule na <6 mm at ≥6 mm ay may mataas na pagkakatulad sa mga metabolomic profile, na nagmumungkahi na ang functional na kahulugan ng benign etiology ay pare-pareho anuman ang laki ng nodule. Samakatuwid, ang mga modernong diagnostic serum metabolite panel ay maaaring magbigay ng isang solong assay bilang isang rule-out test kapag ang mga nodule ay unang natukoy sa CT at potensyal na mabawasan ang serial monitoring. Kasabay nito, ang parehong panel ng mga metabolic biomarker ay nakilala ang mga malignant nodule na ≥6 mm ang laki mula sa mga benign nodule at nagbigay ng mga tumpak na hula para sa mga IPN na may katulad na laki at hindi malinaw na mga morphological na tampok sa mga imahe ng CT. Ang serum metabolism classifier na ito ay mahusay na gumanap sa paghula ng malignancy ng mga nodule na ≥6 mm na may AUC na 0.927. Kung pagsasama-samahin, ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang mga natatanging serum metabolomic signature ay maaaring partikular na sumasalamin sa mga maagang pagbabago sa metabolismo na dulot ng tumor at may potensyal na halaga bilang mga prediktor ng panganib, anuman ang laki ng nodule.
Kapansin-pansin, ang lung adenocarcinoma (LUAD) at squamous cell carcinoma (LUSC) ang mga pangunahing uri ng non-small cell lung cancer (NSCLC). Dahil ang LUSC ay may malakas na kaugnayan sa paggamit ng tabako47 at ang LUAD ang pinakakaraniwang histology ng mga incidental lung nodule na nakita sa CT screening48, ang aming classifier model ay partikular na ginawa para sa mga sample ng stage I adenocarcinoma. Si Wang at mga kasamahan ay nakatuon din sa LUAD at natukoy ang siyam na lipid signature gamit ang lipidomics upang makilala ang early-stage lung cancer mula sa mga malulusog na indibidwal17. Sinubukan namin ang kasalukuyang classifier model sa 16 na kaso ng stage I LUSC at 74 na benign nodule at naobserbahan ang mababang LUSC prediction accuracy (AUC 0.776), na nagmumungkahi na ang LUAD at LUSC ay maaaring may kani-kanilang metabolomic signatures. Sa katunayan, ang LUAD at LUSC ay naipakita na magkaiba sa etiology, biological origin at genetic aberrations49. Samakatuwid, ang iba pang mga uri ng histology ay dapat isama sa mga training model para sa population-based detection ng lung cancer sa mga screening program.
Dito, natukoy namin ang anim na pinakamadalas na nababagong pathway sa lung adenocarcinoma kumpara sa malulusog na kontrol at benign nodules. Ang Xanthine at hypoxanthine ay karaniwang mga metabolite ng purine metabolic pathway. Alinsunod sa aming mga resulta, ang mga intermediate na nauugnay sa purine metabolism ay tumaas nang malaki sa serum o mga tisyu ng mga pasyente na may lung adenocarcinoma kumpara sa malulusog na kontrol o mga pasyente sa preinvasive stage15,50. Ang mataas na antas ng serum xanthine at hypoxanthine ay maaaring sumasalamin sa anabolism na kinakailangan ng mabilis na paglaganap ng mga selula ng kanser. Ang dysregulation ng glucose metabolism ay isang kilalang tanda ng metabolismo ng kanser51. Dito, naobserbahan namin ang isang makabuluhang pagtaas sa pyruvate at lactate sa LA group kumpara sa HC at BN group, na naaayon sa mga nakaraang ulat ng mga abnormalidad sa glycolytic pathway sa mga serum metabolome profile ng mga pasyenteng hindi small cell lung cancer (NSCLC) at malulusog na kontrol. Ang mga resulta ay pare-pareho52,53.
Mahalaga, naobserbahan namin ang isang kabaligtaran na ugnayan sa pagitan ng metabolismo ng pyruvate at tryptophan sa serum ng mga adenocarcinoma sa baga. Ang mga antas ng tryptophan sa serum ay nabawasan sa grupo ng LA kumpara sa grupo ng HC o BN. Kapansin-pansin, natuklasan ng isang nakaraang malawakang pag-aaral gamit ang isang prospective cohort na ang mababang antas ng circulating tryptophan ay nauugnay sa mas mataas na panganib ng kanser sa baga 54. Ang Tryptophan ay isang mahalagang amino acid na nakukuha natin nang buo mula sa pagkain. Napagpasyahan namin na ang pagkaubos ng serum tryptophan sa adenocarcinoma sa baga ay maaaring sumasalamin sa mabilis na pagkaubos ng metabolite na ito. Kilalang-kilala na ang huling produkto ng tryptophan catabolism sa pamamagitan ng kynurenine pathway ang pinagmumulan ng de novo NAD+ synthesis. Dahil ang NAD+ ay pangunahing nalilikha sa pamamagitan ng salvage pathway, ang kahalagahan ng NAD+ sa metabolismo ng tryptophan sa kalusugan at sakit ay kailangan pang matukoy 46. Ipinakita ng aming pagsusuri sa database ng TCGA na ang ekspresyon ng tryptophan transporter solute transporter 7A5 (SLC7A5) ay tumaas nang malaki sa lung adenocarcinoma kumpara sa mga normal na kontrol at positibong nauugnay sa ekspresyon ng glycolytic enzyme na GAPDH. Ang mga nakaraang pag-aaral ay pangunahing nakatuon sa papel ng tryptophan catabolism sa pagsugpo sa antitumor immune response40,41,42. Dito namin ipinapakita na ang pagsugpo sa tryptophan uptake sa pamamagitan ng knockdown ng SLC7A5 sa mga selula ng kanser sa baga ay nagreresulta sa kasunod na pagbaba sa mga antas ng cellular NAD at kasabay na paghina ng glycolytic activity. Sa buod, ang aming pag-aaral ay nagbibigay ng biyolohikal na batayan para sa mga pagbabago sa metabolismo ng serum na nauugnay sa malignant transformation ng lung adenocarcinoma.
Ang mga mutasyon ng EGFR ang pinakakaraniwang mga mutasyon na nagdudulot ng panganib sa mga pasyenteng may NSCLC. Sa aming pag-aaral, natuklasan namin na ang mga pasyenteng may mutasyon ng EGFR (n = 41) ay may pangkalahatang mga metabolomic profile na katulad ng sa mga pasyenteng may wild-type EGFR (n = 31), bagama't natagpuan namin ang pagbaba ng mga antas ng serum ng ilang pasyenteng may EGFR mutant sa mga pasyenteng may acylcarnitine. Ang itinatag na tungkulin ng mga acylcarnitine ay ang pagdadala ng mga acyl group mula sa cytoplasm patungo sa mitochondrial matrix, na humahantong sa oksihenasyon ng mga fatty acid upang makagawa ng enerhiya 55. Kasabay ng aming mga natuklasan, isang kamakailang pag-aaral ang nakatukoy din ng mga katulad na metabolome profile sa pagitan ng mga EGFR mutant at EGFR wild-type tumor sa pamamagitan ng pagsusuri sa pandaigdigang metabolome ng 102 lung adenocarcinoma tissue samples 50. Kapansin-pansin, ang nilalaman ng acylcarnitine ay natagpuan din sa EGFR mutant group. Samakatuwid, kung ang mga pagbabago sa mga antas ng acylcarnitine ay sumasalamin sa mga pagbabago sa metabolismo na dulot ng EGFR at ang mga pinagbabatayan na molecular pathway ay maaaring maging karapat-dapat sa karagdagang pag-aaral.
Bilang konklusyon, ang aming pag-aaral ay nagtatatag ng isang serum metabolic classifier para sa differential diagnosis ng mga pulmonary nodule at nagmumungkahi ng isang workflow na maaaring mag-optimize ng risk assessment at mapadali ang clinical management batay sa CT scan screening.
Ang pag-aaral na ito ay inaprubahan ng Ethics Committee ng Sun Yat-sen University Cancer Hospital, ang First Affiliated Hospital ng Sun Yat-sen University, at ang Ethics Committee ng Zhengzhou University Cancer Hospital. Sa mga grupo ng pagtuklas at panloob na pagpapatunay, 174 na sera mula sa malulusog na indibidwal at 244 na sera mula sa mga benign nodule ang nakolekta mula sa mga indibidwal na sumasailalim sa taunang medikal na eksaminasyon sa Department of Cancer Control and Prevention, Sun Yat-sen University Cancer Center, at 166 na benign nodule. serum. Stage I lung adenocarcinomas ang nakolekta mula sa Sun Yat-sen University Cancer Center. Sa external validation cohort, mayroong 48 kaso ng benign nodule, 39 na kaso ng stage I lung adenocarcinoma mula sa First Affiliated Hospital ng Sun Yat-sen University, at 24 na kaso ng stage I lung adenocarcinoma mula sa Zhengzhou Cancer Hospital. Ang Sun Yat-sen University Cancer Center ay nakakolekta rin ng 16 na kaso ng stage I squamous cell lung cancer upang subukan ang kakayahang mag-diagnose ng itinatag na metabolic classifier (ang mga katangian ng pasyente ay ipinapakita sa Supplementary Table 5). Ang mga sample mula sa discovery cohort at internal validation cohort ay kinolekta sa pagitan ng Enero 2018 at Mayo 2020. Ang mga sample para sa external validation cohort ay kinolekta sa pagitan ng Agosto 2021 at Oktubre 2022. Upang mabawasan ang bias sa kasarian, humigit-kumulang pantay na bilang ng mga kaso ng lalaki at babae ang itinalaga sa bawat cohort. Discovery Team at Internal Review Team. Ang kasarian ng kalahok ay natukoy batay sa self-report. Nakuha ang informed consent mula sa lahat ng kalahok at walang ibinigay na kabayaran. Ang mga subject na may benign nodules ay ang mga may stable na CT scan score sa loob ng 2 hanggang 5 taon sa oras ng pagsusuri, maliban sa 1 kaso mula sa external validation sample, na kinolekta bago ang operasyon at na-diagnose sa pamamagitan ng histopathology. Maliban sa chronic bronchitis. Ang mga kaso ng lung adenocarcinoma ay kinolekta bago ang lung resection at kinumpirma sa pamamagitan ng pathological diagnosis. Ang mga fasting blood sample ay kinolekta sa mga serum separation tube nang walang anumang anticoagulant. Ang mga sample ng dugo ay namuo sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid at pagkatapos ay sinentrifuga sa 2851 × g sa loob ng 10 minuto sa 4°C upang kolektahin ang serum supernatant. Ang mga serum aliquot ay pinalamig sa -80°C hanggang sa makuha ang metabolite. Ang Department of Cancer Prevention and Medical Examination ng Sun Yat-sen University Cancer Center ay nakakolekta ng isang pool ng serum mula sa 100 malulusog na donor, kabilang ang pantay na bilang ng mga kalalakihan at kababaihan na may edad 40 hanggang 55 taon. Magkaparehong dami ng bawat sample ng donor ang hinalo, ang nagresultang pool ay pinaghiwalay at iniimbak sa -80°C. Ang pinaghalong serum ay ginamit bilang reference material para sa quality control at data standardization.
Ang mga reference serum at test sample ay tinunaw at ang mga metabolite ay kinuha gamit ang isang combined extraction method (MTBE/methanol/tubig) 56. Sa madaling salita, 50 μl ng serum ang hinaluan ng 225 μl ng ice-cold methanol at 750 μl ng ice-cold methyl tert-butyl ether (MTBE). Haluin ang timpla at i-incubate sa yelo sa loob ng 1 oras. Ang mga sample ay hinaluan at ini-vortex na hinaluan ng 188 μl ng MS-grade na tubig na naglalaman ng internal standards (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, at 13C6-isoleucine, na binili mula sa Cambridge Isotope Laboratories). Ang timpla ay isinailalim sa centrifuge sa 15,000 × g sa loob ng 10 minuto sa 4 °C, at ang lower phase ay inilipat sa dalawang tubo (125 μL bawat isa) para sa LC-MS analysis sa positive at negative modes. Panghuli, ang sample ay pinasingaw hanggang sa matuyo sa isang high-speed vacuum concentrator.
Ang mga pinatuyong metabolite ay muling binuo sa 120 μl ng 80% acetonitrile, ini-vortex sa loob ng 5 minuto, at isinailalim sa centrifuge sa 15,000 × g sa loob ng 10 minuto sa 4°C. Ang mga supernatant ay inilipat sa mga vial na gawa sa amber glass na may mga microinsert para sa mga pag-aaral ng metabolomics. Untargeted metabolomics analysis sa isang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) platform. Ang mga metabolite ay pinaghiwalay gamit ang isang Dionex Ultimate 3000 UPLC system at isang ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Sa positive ion mode, ang mga mobile phase ay 95% (A) at 50% acetonitrile (B), bawat isa ay naglalaman ng 10 mmol/L ammonium acetate at 0.1% formic acid. Sa negative mode, ang mga mobile phase A at B ay naglalaman ng 95% at 50% acetonitrile, ayon sa pagkakabanggit, ang parehong phase ay naglalaman ng 10 mmol/L ammonium acetate, pH = 9. Ang gradient program ay ang mga sumusunod: 0–0.5 min, 2% B; 0.5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16.1 min, 98 –2% B; 16.1–20 min, 2% B. Ang column ay pinanatili sa 40°C at ang sample sa 10°C sa autosampler. Ang flow rate ay 0.3 ml/min, ang injection volume ay 3 μl. Isang Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) na may electrospray ionization (ESI) source ang pinatakbo sa full scan mode at isinama sa ddMS2 monitoring mode upang mangolekta ng malalaking volume ng data. Ang mga MS parameter ay itinakda gaya ng sumusunod: spray voltage +3.8 kV/- 3.2 kV, capillary temperature 320°C, shielding gas 40 arb, auxiliary gas 10 arb, probe heater temperature 350°C, scanning range 70–1050 m/ h, resolution 70 000. Nakuha ang data gamit ang Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Upang masuri ang kalidad ng datos, ang mga pinagsamang sample ng quality control (QC) ay nabuo sa pamamagitan ng pag-alis ng 10 μL aliquots ng supernatant mula sa bawat sample. Anim na iniksyon ng sample ng quality control ang sinuri sa simula ng analytical sequence upang masuri ang katatagan ng UPLC-MS system. Ang mga sample ng quality control ay pana-panahong ipinapasok sa batch. Lahat ng 11 batch ng mga sample ng serum sa pag-aaral na ito ay sinuri gamit ang LC-MS. Ang mga aliquot ng isang serum pool mixture mula sa 100 malulusog na donor ay ginamit bilang reference material sa kani-kanilang mga batch upang masubaybayan ang proseso ng pagkuha at isaayos para sa mga epekto sa bawat batch. Ang untargeted metabolomics analysis ng discovery cohort, internal validation cohort, at external validation cohort ay isinagawa sa Metabolomics Center ng Sun Yat-sen University. Ang external laboratory ng Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center ay sinuri rin ang 40 sample mula sa external cohort upang subukan ang performance ng classifier model.
Pagkatapos ng pagkuha at muling pagbubuo, ang ganap na dami ng mga metabolite sa serum ay sinukat gamit ang ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Agilent 6495 triple quadrupole) na may electrospray ionization (ESI) source sa multiple reaction monitoring (MRM) mode. Isang ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) ang ginamit upang paghiwalayin ang mga metabolite. Ang mobile phase ay binubuo ng 90% (A) at 5% acetonitrile (B) na may 10 mmol/L ammonium acetate at 0.1% ammonia solution. Ang gradient program ay ang mga sumusunod: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0%B. Ang kolum ay pinanatili sa 40 °C at ang sample sa 10 °C sa autosampler. Ang flow rate ay 0.3 mL/min at ang injection volume ay 1 μL. Ang mga MS parameter ay itinakda tulad ng sumusunod: capillary voltage ±3.5 kV, nebulizer pressure 35 psi, sheath gas flow 12 L/min, sheath gas temperature 350°C, drying gas temperature 250°C, at drying gas flow 14 l/min. Ang MRM conversions ng tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine at xanthine ay 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 at 151.0–107.9 ayon sa pagkakabanggit. Ang datos ay kinolekta gamit ang Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Para sa mga sample ng serum, ang tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, at xanthine ay tinantiya gamit ang mga calibration curve ng mga karaniwang solusyon ng pinaghalong sangkap. Para sa mga sample ng selula, ang nilalaman ng tryptophan ay na-normalize sa internal standard at cell protein mass.
Ang peak extraction (m/z at retention time (RT)) ay isinagawa gamit ang Compound Discovery 3.1 at TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Upang maalis ang mga potensyal na pagkakaiba sa pagitan ng mga batch, ang bawat characteristic peak ng test sample ay hinati sa characteristic peak ng reference material mula sa parehong batch upang makuha ang relatibong kasaganaan. Ang relatibong standard deviations ng mga internal standard bago at pagkatapos ng standardization ay ipinapakita sa Supplementary Table 6. Ang mga pagkakaiba sa pagitan ng dalawang grupo ay nailalarawan sa pamamagitan ng false discovery rate (FDR<0.05, Wilcoxon signed rank test) at fold change (>1.2 o <0.83). Ang raw MS data ng mga nakuhang feature at reference serum-corrected MS data ay ipinapakita sa Supplementary Data 1 at Supplementary Data 2, ayon sa pagkakabanggit. Ang peak annotation ay isinagawa batay sa apat na tinukoy na antas ng pagkakakilanlan, kabilang ang mga natukoy na metabolite, mga compound na may annotation, mga compound na may characterization, at mga unknown compound 22. Batay sa mga paghahanap sa database sa Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), ang mga biological compound na may mga napatunayang pamantayan na tumutugma sa MS/MS o mga anotasyon ng eksaktong tugma sa mzCloud (iskor > 85) o Chemspider ay sa wakas ay napili bilang mga intermediate sa pagitan ng differential metabolome. Ang mga peak anotation para sa bawat tampok ay kasama sa Supplementary Data 3. Ginamit ang MetaboAnalyst 5.0 para sa univariate analysis ng sum-normalized metabolite abundance. Sinuri rin ng MetaboAnalyst 5.0 ang KEGG pathway enrichment analysis batay sa mga metabolite na may makabuluhang magkakaibang pagkakaiba. Ang principal component analysis (PCA) at partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) ay sinuri gamit ang ropls software package (v.1.26.4) na may stack normalization at autoscaling. Ang pinakamainam na metabolite biomarker model para sa paghula ng nodule malignancy ay nabuo gamit ang binary logistic regression na may least absolute shrinkage at selection operator (LASSO, R package v.4.1-3). Ang pagganap ng discriminant model sa mga detection at validation sets ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagtantya sa AUC batay sa ROC analysis ayon sa pROC package (v.1.18.0.). Ang optimal probability cutoff ay nakuha batay sa maximum Youden index ng modelo (sensitivity + specificity – 1). Ang mga sample na may mga halagang mas mababa o mas mataas sa threshold ay mahuhulaan bilang benign nodules at lung adenocarcinoma, ayon sa pagkakabanggit.
Ang mga A549 na selula (#CCL-185, American Type Culture Collection) ay pinalaki sa F-12K medium na naglalaman ng 10% FBS. Ang mga short hairpin RNA (shRNA) sequence na tumatarget sa SLC7A5 at isang nontargeting control (NC) ay ipinasok sa lentiviral vector pLKO.1-puro. Ang mga antisense sequence ng shSLC7A5 ay ang mga sumusunod: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGAATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Ang mga antibodies sa SLC7A5 (#5347) at tubulin (#2148) ay binili mula sa Cell Signaling Technology. Ang mga antibodies sa SLC7A5 at tubulin ay ginamit sa dilution na 1:1000 para sa Western blot analysis.
Sinusukat ng Seahorse XF Glycolytic Stress Test ang mga antas ng extracellular acidification (ECAR). Sa assay, ang glucose, oligomycin A, at 2-DG ay ibinigay nang sunud-sunod upang subukan ang kapasidad ng cellular glycolytic na sinukat ng ECAR.
Ang mga selulang A549 na na-transfect gamit ang non-targeting control (NC) at shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ay inilagay magdamag sa mga lalagyang may 10 cm na diyametro. Ang mga metabolite ng selula ay kinuha gamit ang 1 ml ng malamig na 80% aqueous methanol. Ang mga selula sa solusyon ng methanol ay kinayod, tinipon sa isang bagong tubo, at isinailalim sa centrifugation sa 15,000 × g sa loob ng 15 minuto sa 4°C. Kolektahin ang 800 µl ng supernatant at patuyuin gamit ang isang high-speed vacuum concentrator. Ang mga pinatuyong metabolite pellets ay sinuri para sa mga antas ng tryptophan gamit ang LC-MS/MS gaya ng inilarawan sa itaas. Ang mga antas ng cellular NAD(H) sa mga selulang A549 (NC at shSLC7A5) ay sinukat gamit ang isang quantitative NAD+/NADH colorimetric kit (#K337, BioVision) ayon sa mga tagubilin ng gumawa. Ang mga antas ng protina ay sinukat para sa bawat sample upang gawing normal ang dami ng mga metabolite.
Walang ginamit na mga istatistikal na pamamaraan upang paunang matukoy ang laki ng sample. Ang mga nakaraang pag-aaral ng metabolomics na naglalayong tuklasin ang biomarker15,18 ay itinuturing na mga benchmark para sa pagtukoy ng laki, at kumpara sa mga ulat na ito, ang aming sample ay sapat. Walang mga sample ang ibinukod mula sa cohort ng pag-aaral. Ang mga sample ng serum ay random na itinalaga sa isang discovery group (306 na kaso, 74.6%) at isang internal validation group (104 na kaso, 25.4%) para sa mga hindi naka-target na pag-aaral ng metabolomics. Random din kaming pumili ng 70 kaso mula sa bawat grupo mula sa discovery set para sa mga naka-target na pag-aaral ng metabolomics. Ang mga imbestigador ay nabulag sa pagtatalaga ng grupo habang nangongolekta at nag-aanalisa ng datos ng LC-MS. Ang mga istatistikal na pagsusuri ng datos ng metabolomics at mga eksperimento sa cell ay inilalarawan sa kani-kanilang mga seksyon ng Resulta, Mga Alamat ng Larawan, at Mga Paraan. Ang pagkuwantipika ng cellular tryptophan, NADT, at aktibidad ng glycolytic ay isinagawa nang tatlong beses nang magkahiwalay na may magkaparehong mga resulta.
Para sa karagdagang impormasyon tungkol sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang Natural Portfolio Report Abstract na kaugnay ng artikulong ito.
Ang hilaw na datos ng MS ng mga nakuhang katangian at ang na-normalize na datos ng MS ng reference serum ay ipinapakita sa Karagdagang Datos 1 at Karagdagang Datos 2, ayon sa pagkakabanggit. Ang mga peak anotation para sa mga katangiang naiiba ay ipinapakita sa Karagdagang Datos 3. Ang dataset ng LUAD TCGA ay maaaring ma-download mula sa https://portal.gdc.cancer.gov/. Ang input data para sa pag-plot ng graph ay ibinibigay sa pinagmulang datos. Ang pinagmulang datos ay ibinigay para sa artikulong ito.
Pambansang Grupo ng Pag-aaral sa Pagsusuri ng Baga, atbp. Pagbabawas ng dami ng namamatay dahil sa kanser sa baga gamit ang low-dose computed tomography. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR at Prophet, PC Screening ng kanser sa baga gamit ang low-dose helical CT: mga resulta mula sa National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Pagbabawas ng mortalidad dahil sa kanser sa baga gamit ang volumetric CT screening sa isang randomized trial. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Oras ng pag-post: Set-18-2023