Ang Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) ay isang third-generation genome editing technique na nagpabago sa mundo gamit ang high-throughput results nito. Ginamit ito upang gamutin ang iba't ibang biological na sakit at impeksyon. Ang iba't ibang bacteria at iba pang prokaryotes (tulad ng archaea) ay mayroon ding CRISPR/Cas9 systems upang ipagtanggol laban sa mga phage. Naiulat na ang mga estratehiyang nakabatay sa CRISPR/Cas9 ay maaaring pumigil sa paglaki at paglala ng triple negative breast cancer (TNBC) sa pamamagitan ng pag-target sa mga potensyal na nabagong resistance genes, transcription, at epigenetic regulation. Ang mga therapeutic intervention na ito ay maaaring makatulong sa pagtugon sa mga mapaghamong problema tulad ng drug resistance na naobserbahan kahit sa TNBC. Sa kasalukuyan, iba't ibang pamamaraan ang ginagamit upang maihatid ang CRISPR/Cas9 sa mga target na cell, tulad ng physical (microinjection, electroporation at hydrodynamic modes), viral (adeno-associated virus at lentivirus) at non-viral (liposomes at lipid nanoparticles). )-particles). Bagama't iba't ibang modelo ang nabuo upang pag-aralan ang mga molekular na sanhi ng TNBC, ang kakulangan ng sensitibo at naka-target na mga pamamaraan para sa paghahatid ng mga tool sa pag-edit ng genome in vivo ay naglilimita sa kanilang klinikal na aplikasyon. Sa buod, komprehensibong sinusuri ng pagsusuring ito ang pag-unlad, mga hamon, mga limitasyon, at mga inaasam-asam ng paggamot ng CRISPR/Cas9 para sa TNBC batay sa umiiral na ebidensya. Itinatampok din namin kung paano mapapabuti ng kombinasyon ng artificial intelligence at machine learning ang mga estratehiya ng CRISPR/Cas9 sa paggamot ng TNBC.
Ang kanser ay nailalarawan sa pamamagitan ng hindi makontrol na paghahati ng selula, pagkagambala sa mga checkpoint ng cell cycle, at mga mutasyon sa mga tumor suppressor gene (TSG) (Matthews et al., 2022). Sa iba't ibang uri ng kanser, ang kanser sa suso ang pinakakaraniwang uri ng kanser sa kababaihan at may mataas na antas ng namamatay sa buong mundo (Waks at Winer, 2019). Ang kanser sa suso ay isang heterogeneous na sakit na may magkakaibang katangian, tulad ng mga histological at biological na katangian, klinikal na presentasyon at pag-uugali, at tugon sa paggamot (Weigelt et al., 2010). Ang klasipikasyon ng kanser sa suso ay nagbibigay ng tumpak na mga pananaw para sa diagnosis ng kanser sa suso at prognosis ng tumor. Ang paggamit ng mga karaniwang biomarker at mga clinicopathological na katangian ang naging pangunahing pamantayan para sa klasipikasyon ng kanser sa suso (Tsang at Tse, 2019). Ang prognosis at tugon sa paggamot ng kanser sa suso ay naiimpluwensyahan ng maraming salik, kabilang ang pagkakaroon ng estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu), at histological grade, uri ng tumor, at grade, laki at lymph node metastasis (Al-Tubaiti, 2020). Limang intrinsic molecular subtypes ng kanser sa suso ang natukoy, kabilang ang luminal A, luminal B, HER2-enriched, basal-like, at claudin-low (Prat et al., 2015). Ang TNBC ay isang molecular subtype ng kanser na hindi nagpapahayag ng lahat ng ER, PR, at HER2 (Yin et al., 2020). Ang mga pathological feature na ito ay nauugnay sa TNBC, na nagpapatunay sa mabilis na pag-unlad at mas agresibong katangian nito kaysa sa anumang iba pang uri ng kanser sa suso (Feng et al., 2018). Bukod pa rito, ginamit ni Peru et al (2000) ang teknolohiyang microarray upang muling uriin ang kanser sa suso at tukuyin ang limang intrinsic subtypes ng kanser sa suso (Cadenas, 2012). Ang basal-like breast cancer ay isang subtype ng kanser sa suso na may triple-negative phenotype at nauugnay sa mabilis na pag-unlad. Dapat tandaan na ang lahat ng basal-like breast cancers ay karaniwang napagkakamalang TNBC, ngunit 77% lamang ang TNBC; Sa kabaligtaran, 71–91% ng TNBC ay basal-like, na nagpapahiwatig na ang dalawang uri ng kanser sa suso ay nagsasapawan at kumakatawan sa magkaibang klasipikasyon (Wang D.-Y. et al., 2019). Lumilikha ito ng pangangailangang kilalanin ang heterogeneity ng TNBC upang maipaliwanag ang prognosis at matukoy ang mga potensyal na tugon sa kasalukuyan at mga paggamot sa hinaharap. Bukod pa rito, ang TNBC ay bumubuo sa 15–20% ng lahat ng kaso ng kanser sa suso at mas karaniwan sa mga kababaihang wala pang 50 taong gulang. Ang mga mutasyon ng BRCA1 o BRCA2 ay naiulat sa humigit-kumulang 20% ng mga kaso ng TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Ipinakita rin ng mga pag-aaral na ang TNBC ay may natatanging immune microenvironment na kinabibilangan ng mataas na antas ng vascular endothelial growth factors, tumor-associated macrophages (TAMs), tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), at iba pang mga molekula na kasangkot sa paglaki at paglipat ng tumor. Samakatuwid, ang pag-unawa sa microenvironment ng TNBC ay mahalaga para sa prognosis at paggamot nito (Fan at He, 2022).
Upang masuri ang prognosis ng TNBC at matiyak ang epektibong paggamot, mahalaga ang tumpak na diagnosis, pangunahin batay sa immunohistochemistry (IHC) upang matukoy ang ER, PR at HER2, at mammography upang matukoy ang mga neoplasma sa suso. Gayunpaman, hindi sapat na maipapakita ng mammography ang mga intratumoral na katangian tulad ng necrosis at fibrosis (Deepak Singh et al., 2021). Dahil ang mahinang prognosis at diagnosis ay pumipigil sa mga doktor na magreseta ng mga tamang gamot (Chaudhary, 2020), iba't ibang estratehiya ang ginagamit upang mapabuti ang pangangalaga para sa mga pasyenteng may TNBC. Sa kasalukuyan, dalawang gamot, ang doxorubicin at cyclophosphamide, ang ginagamit sa mga pasyenteng may TNBC at nagpakita ng magagandang resulta. Bukod pa rito, ginagamit din ang iba pang mga platinum na gamot, tulad ng carboplatin at cisplatin (Sikov et al., 2015). Bukod pa rito, ang mga PARP inhibitor tulad ng Olaparib, Velaparib, at PF-01367338 ay ginamit bilang mga potensyal na chemotherapy na gamot para sa paggamot ng TNBC (Ishino et al., 2018). Dahil naiulat na ang mga Wnt/b-Catenin, NOTCH, at Hedgehog signaling pathway ay sangkot sa paglitaw at pag-unlad ng TNBC, ang pag-target ng mga gamot sa mga pathway na ito ay maaaring isang mahalagang estratehiya (Aysola et al., 2013). Bagama't nananatiling pangunahing paggamot para sa TNBC ngayon ang operasyon, radiation therapy, at chemotherapy, malaki ang naisulong na pag-unlad sa pagbuo ng mga bagong paggamot kabilang ang targeted therapy, immunotherapy, iba't ibang CRISPR-related gene editing tools tulad ng Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, prime editing, at CRISPR/Cas9-targeted gene therapy. Dito ay tututuon tayo sa iba't ibang CRISPR-related gene editing tools na ginagamit sa paggamot ng TNBC. Kabilang sa mga ito, ang CRISPR/Cas9 ay nakatanggap ng malawakang atensyon.
Ang Cas9n, kilala rin bilang Cas9 nickase, ay isang genetically engineered variant ng Cas9 protein na nagmula sa CRISPR/Cas9 genome editing system (Gupta et al., 2019). Sa orihinal nitong anyo, ang Cas9 protein ay naglalaman ng dalawang nuclease domain: RuvC at HNH, na ang pangunahing tungkulin ay ang paghiwalay ng parehong DNA strands. Gayunpaman, sa Cas9n, ang isa sa mga nuclease domain, ang HNH, ay genetically mutated at nagiging inactive. Samakatuwid, ang HNH domain ng Cas9n ay nananatiling hindi gumagana. Tanging ang RuvC domain lamang ang nananatiling aktibo, na nagpapahintulot sa Cas9n na putulin o lumikha ng mga break sa mga single DNA strands (Trevino at Zhang, 2014). Kung ikukumpara sa Cas9n, ang Cas9n ay epektibong makakabawas ng mga off-target effect at tumpak na mapapabuti ang mga mekanismo ng pagkukumpuni ng cell. Maaaring gamitin ang Cas9n upang malutas ang iba't ibang problema, tulad ng paglikha ng mga break sa mga partikular na lokasyon sa double-stranded DNA. Para sa layuning ito, dalawang Cas9n molecule ang pinagsama at ginamit nang magkasama (Yee, 2016). Ang mixed lineage kinase 3 (MLK3) ay isang mitogen-activated protein kinase na nagsisilbing pangunahing regulator sa panahon ng TNBC metastasis (Cronan et al., 2012).
Maaaring i-activate ng MLK3 ang maraming signaling pathway na humahantong sa TNBC metastasis. Halimbawa, ang c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway ay nagreregula sa cell motility at extracellular matrix degradation, at ang MLK3 ay nagreregula sa JNK pathway, sa gayon ay pinahuhusay ang cell motility at nagbibigay ng mga invasive properties (Rattanasinchai at Gallo, 2016). Kinokontrol din ng MLK3 ang EMT. Upang magawa ito, pinapagana nito ang mga downstream transcription factor tulad ng Snail, Slug at Twist. Pinipigilan ng mga salik na ito ang ekspresyon ng mga epithelial marker at itinataguyod ang ekspresyon ng mga mesenchymal marker, na humahantong sa pagkakaroon ng metastatic phenotype (Casalino et al., 2023). Naobserbahang may papel ang MLK3 sa ECM remodeling at activation ng mga protease tulad ng matrix metalloproteinases (MMPs) na nagpapababa sa ECM. Pinapadali nito ang pagsalakay ng tumor cell at pagkalat sa malalayong lugar (Katari et al., 2019). Kaya, ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang MLK3 ay gumaganap ng isang kritikal na papel sa TNBC. Ginamit nina Rattanasinchai at Gallo ang mga modelo ng TNBC upang pag-aralan ang papel ng MLK3 at natuklasan na itinataguyod nito ang pag-unlad ng kanser sa pamamagitan ng mga partikular na pathway ng pagbibigay ng senyas. Ginamit nila ang CRISPR/Cas9n upang i-edit ang MLK3 at naobserbahan ang isang makabuluhang pagbawas sa metastasis ng TNBC (Rattanasinchai at Gallo, 2016).
Ang dCas9, na kadalasang tinatawag na inactive Cas9, ay isang binagong derivative form ng Cas9 protein. Hindi tulad ng aktibong Cas9, ang dCas9 ay walang endonuclease activity, kaya hindi nito kayang mag-induce ng DNA double-strand breaks. Samakatuwid, maaaring gamitin ang dCas9 upang tumpak na i-target ang mga partikular na rehiyon ng genome nang walang anumang pagbabago o modipikasyon sa DNA sequence (Wang et al., 2016). Sa dCas9, dalawang endonuclease protein, ang RuvC at HNH, ay ina-inactivate sa pamamagitan ng pagsugpo sa mahahalagang amino acid residues. (Richter et al., 2016). Sa kabila ng kawalan nito ng DNA cleavage activity, ang dCas9 ay gumaganap ng ilang mahahalagang papel sa genetic research at biotechnology. Halimbawa, pinapayagan nito ang visualization ng mga partikular na rehiyon ng genome, pinapadali ang transcriptional regulation, at nagtataguyod ng epigenetic modifications (Brocken et al., 2018).
Ang transcription factor na ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) ay gumaganap ng isang tiyak at kritikal na papel sa pagpapamagitan ng epithelial-mesenchymal transition (EMT), isang proseso ng cellular na nangyayari sa panahon ng embryonic development, tissue repair, at cancer progression. Kabilang dito ang pagbabago ng mga epithelial cell tungo sa mesenchymal cells, na nagreresulta sa mga pagbabago sa morphology ng cell, motility, invasiveness, atbp. (Wu et al., 2020). Pinipigilan ng ZEB1 ang maraming epithelial marker, tulad ng E-cadherin at Occludin, na responsable sa pagpapanatili ng cell-cell adhesion at polarity ng mga epithelial cell sa TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Bukod pa rito, pinapagana ng ZEB1 ang ilang partikular na marker tulad ng N-cadherin, vimentin at fibronectin (Konradi et al., 2014) at kinokontrol din ang mga gene na kasangkot sa cytoskeletal remodeling tulad ng Rho GTPases at matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), bilang karagdagan, nakakaapekto rin ito sa iba't ibang mga signaling pathway tulad ng transforming growth factor-β (TGF-β), Wnt signaling, atbp., sa gayon ay nagtataguyod ng pagsalakay ng tumor at metastasis sa TNBC (Chen et al., 2016). Maraming mga pag-aaral at siyentipikong ebidensya ang nagpapahiwatig na ang ZEB1 ay may malaking potensyal bilang isang mahalagang ahente para sa pagtuklas at therapeutic intervention ng TNBC. Sa isang kamakailang pag-aaral, ginamit nina Waryah et al. ang isang TNBC model at nakamit ang kumpletong pagsugpo sa ZEB1 ng dCas9. Kaya, naobserbahan nila ang napakataas na specificity at halos kumpletong inhibition ng ZEB1 sa mga kondisyong in vivo (Waryah et al., 2023).
Ang CRISPR/Cas12 ay isang gene editing tool na tinatawag na CRISPR/Cpf1. Ito ay hango sa CRISPR/Cas system, kung saan ang terminong Cas12 ay tumutukoy sa CRISPR-associated protein 12 (Bharathkumar et al., 2022), na halos kapareho ng Cas9. Ang pagkakaiba lamang ay naglalaman ito ng Cas12 protein. Kung ikukumpara sa Cas9, ang Cas12 ay may ilang natatanging tungkulin tulad ng pagbuo ng malagkit na dulo habang nasa proseso ng gene editing, samantalang ang Cas9 ay bumubuo ng mapurol na dulo (Wang et al., 2021). Ang katangiang ito ng Cas12 ay nakakatulong sa partikular nitong teknolohiya sa pagmamanipula ng DNA. Bilang isang protina na may kakayahang tumpak na makilala at putulin ang target na DNA, mayroon itong pambihirang kakayahang magamit, kaya isa itong epektibong tool para sa iba't ibang aplikasyon, kabilang ang gene editing (Pickar-Oliver at Gersbach, 2019).
Katulad ng ibang mga variant ng CRISPR, ang CRISPR/Cas12 ay may kakayahang pumutol o mag-activate ng mga gene sa TNBC, na tinatarget ang mga gene na may mahalagang papel sa pathogenesis o tugon nito sa paggamot (Yang at Zhang, 2023). Upang maisakatuparan ang prosesong ito, isang guide RNA (gRNA) ang binuo na nagdidirekta sa Cas12 patungo sa target gene. Kapag ang Cas12 ay nakagapos sa target nito, nagpapakilala ito ng mga double-strand break sa DNA at nagpapagana ng mga mekanismo ng pagkukumpuni ng DNA. Sa panahon ng proseso ng pagkukumpuni, maaaring maisama ang mga maling nucleotide, na humahantong sa mga mutasyon ng gene at pagkawala ng function (Zhang et al., 2021a). Bilang karagdagan, isang pinahusay na bersyon ng Cas12 enzyme (tinatawag na dCas12) ang ginamit din upang i-activate ang mga gene. Sa pamamagitan ng pagsasama nito sa isang transcription activator, posible na ma-induce ang ilang mga gene, sa gayon ay ma-activate ang mga ito. Ang teknolohiyang ito ay may malaking potensyal sa pagtataguyod ng pag-activate ng mga tumor suppressor gene (Sultan et al., 2022).
Ang prime editing ay isang bagong binuo at lubos na nakahihigit na teknolohiya sa pag-edit ng genome. Kaya nitong baguhin ang DNA ng isang organismo nang napakatumpak (Chen at Liu, 2023). Nakakamit ang prime editing sa pamamagitan ng pagsasama ng dalawang pangunahing bahagi: isang binagong CRISPR/Cas9 enzyme at reverse transcriptase. Ang papel ng CRISPR/Cas9 enzyme ay ang piliing pag-target ng mga tiyak na site sa genome, habang ang reverse transcriptase ay nakakatulong upang lubusang baguhin ang DNA sa target na lokasyon (Hassan et al., 2021). Sa mekanismo ng primer editing, ang unang hakbang ay kinabibilangan ng paglikha ng isang primer editing guide RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Naglalaman ito ng target sequence at RNA template na naaayon sa nais na editing site sa target na DNA. Ang pegRNA ay ipinapasok sa mga target na cell kasama ang isang primer editing nuclease (PE2). Ang PE2 ay isang fusion protein na binubuo ng isang Cas9 enzyme, isang reverse transcriptase, at isang primer editing adapter (Martín-Alonso et al., 2021). Sa loob ng selula, hinahanap ng pegRNA at PE2 complexes ang partikular na DNA na gusto nilang baguhin. Pinuputol ng Cas9 enzyme ang DNA at lumilikha ng template na binubuo ng mga single strand (Choi et al., 2022). Ginagamit ng reverse transcriptase ang template na ito upang ihanda ang DNA para sa pag-eedit. Kasama sa pagkopya ng DNA, kasama rin ang mga tagubilin para sa pag-eedit ng RNA template. Panghuli, ang bagong gawang DNA strand ay ginagamit bilang template upang ayusin ang sira sa DNA, na nagreresulta sa isang binagong DNA sequence na naglalaman ng ninanais na pagbabago (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Ang mga mekanismo ng primer editing ay maaaring humantong sa malawakang mutasyon sa mga gene. Maaari nitong i-target ang mga point mutation, insertion, deletion, at maging ang mga gene replacement (Anzalone et al., 2019; Chen at Liu, 2023). Ang prime editing ay nag-aalok ng ilang bentahe kumpara sa mga nakaraang teknolohiya sa pag-eedit ng genome. Kabilang dito ang mas mataas na katumpakan, nabawasang off-target effect, at ang kakayahang i-edit ang DNA nang hindi umaasa sa mga DNA double-strand break (Anzalone et al., 2020).
Ang teknolohiyang CRISPR/Cas9 ay orihinal na binuo upang protektahan ang bakterya mula sa paglilipat ng plasmid at impeksyon ng phage at kalaunan ay ginamit muli bilang isang epektibong tool sa pag-target ng DNA na nakabatay sa RNA para sa pag-edit ng genome (Jiang at Doudna, 2017). Bukod pa rito, ang sistemang CRISPR/Cas9 ay naiulat na naroroon sa 50% at 87% ng mga bacterial at archaeal genome, ayon sa pagkakabanggit (Ishino et al., 2018). Ang CRISPR/Cas9 ay isang potensyal na tool para sa pagtanggal, pagpasok at pagwawasto ng anumang abnormal na genetic sequence gamit ang in vivo at in vitro modes (Sabit et al., 2021). Bukod dito, ang CRISPR/Cas9 ay ipinakita na bahagi ng adaptive immune system dahil sa pagiging tiyak nito para sa mga target gene na pinag-aaralan (Chen at Zhang, 2018).
Ang CRISPR/Cas9 ay binubuo ng Cas9 at isang single guide RNA (sgRNA). Ang Cas9 ay isang endonuclease na binubuo ng maraming bahagi ng protina. Bukod pa rito, ang Cas9 ay may natatanging mga katangiang istruktural at konpormasyonal (Pacesa et al., 2022) dahil binubuo ito ng dalawang lobe: recognition (REC) at nuclease (NUC). Ang REC lobe ay nahahati pa sa tatlong rehiyon: REC1, REC2, at bridge helices (Cromwell et al., 2018). Ang NUC ay binubuo ng tatlong lobe, katulad ng RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH at ang protospacer adjacent motif (PAM) interaction domain (Fig. 1) (Song et al., 2016). Ang sgRNA ay binubuo ng dalawang bahagi, kabilang ang CRISPR RNA (crRNA) at transcoding small RNA (tracer RNA) (Figure 1). Ang sgRNA ang nag-uugnay sa Cas9 protein sa mga connexin upang bumuo ng isang aktibong complex, na kilala rin bilang effector complex (Richter et al., 2012). Ang crRNA ay isang 18-20 nucleotide base pair na gumaganap ng isang kritikal na papel sa pagkilala sa mga target na sequence ng DNA. Bukod pa rito, ang crRNA ay nagpapares sa target na DNA, at ang tracrRNA ay nagsisilbing scaffold para sa Cas9 nuclease upang magbigkis sa target na DNA (Manghwar et al., 2019). Sa kabilang banda, ang PAM sequence ay may 3 nucleotides, na nagpapatunay, tumutukoy, at namamagitan sa pagbubuklod ng effector complex sa DNA. Ang mga subunit ng Cas9 protein complex na RuvC at HNH ay may catalytic activity (Richter et al., 2012; Asmamaw at Zawdie, 2021). Ang HNH nuclease domain ng Cas9 subunit ay pumiputol sa DNA strand na nauugnay sa crRNA. Pinuputol ng RuvC nuclease domain ang iba pang mga hibla ng DNA at bumubuo ng mga double-strand break (DSB), kung saan pagkatapos nito ay dalawang magkaibang mekanismo ng pagkukumpuni ng pagkasira ng DNA ang isinasaaktibo (Jiang at Doudna, 2017) (Larawan 1).
Pigura 1. Pangkalahatang-ideya ng CRISPR/Cas9 (A). Mga bahagi ng sistemang CRISPR/Cas9: (i). Ang Cas9 endonuclease ay responsable sa pagputol ng target na DNA sequence, (ii) isang single guide (sg) RNA na resulta ng pagsasanib ng crRNA at tra-crRNA chimera. (dalawa). Kasama sa Cas9 ang ilang bahagi tulad ng Rec I, Rec II, NUC lobe (ang HNH at Ruv C ay mga subcomponent) at PAM interaction domain (C) na may kaukulang mga tungkulin. Hinahati ng CRISPR/Cas9 protein complex ang mga DNA sequence sa mga di-komplementaryo at komplementaryong anyo (D). Binabago ng CRISPR/Cas9 ang genome sa tatlong yugto: pagkilala, pagputol at pagkukumpuni. Ang dinisenyong sg-RNA ay gumagabay sa Cas9 at kinikilala ang ninanais na sequence sa pamamagitan ng komplementaryong bahaging crRNA. Kinikilala ng Cas9 ang PAM sequence sa 5′-NGG-3′ at tinutunaw ang DNA, na bumubuo ng DNA-RNA hybrid at nagpapagana ng cleavage. Ang HNH domain ng Cas9 ay pumuputol sa komplementaryong strand, at ang RuvC domain naman ay pumuputol sa hindi komplementaryong strand. Inaayos ng CRISPR/Cas9 ang dsDNA sa pamamagitan ng pagbasag nito sa dalawang paraan: non-homologous end joining (NHEJ) at homology-directed repair (HDR). Inaayos ng NHEJ ang double-stranded DNA nang walang dayuhang homologous DNA sa pamamagitan ng isang enzymatic process, isang mekanismong madaling magkamali na maaaring magpasok o mag-alis ng mga random na sequence ng DNA. Ang HDR ay napaka-specific at nangangailangan ng mga homologous na template ng DNA.
Ang mga pathway ng pagkukumpuni na pinamagitan ng CRISPR/Cas9 ay kinabibilangan ng mga mekanismong non-homologous end joining (NHEJ) at homology-directed repair (HDR). Ang NHEJ ay isang path na madaling magkamali dahil kinabibilangan ito ng pagpasok o pagbura at hindi nangangailangan ng anumang pattern sa panahon ng mekanismo ng pagkukumpuni. Gumagamit ito ng mga random na nucleotide upang makabuo ng mga karaniwang protina (Abbasi et al., 2021). Ang sistemang ito ng pagkukumpuni ay binubuo ng apat na complex tulad ng KU complex, ang cross-complementing protein complex type 4 (XRCC-4), ang DNA end processing enzyme, at ang protein kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Ang protina ng KU complex ay may dalawang subunit, ang Ku 70 at Ku 80, at gumaganap ng mahalagang papel sa mekanismo ng NHEJ, dahil ang mekanismo ng pagkukumpuni ay sinisimulan sa pamamagitan ng pagbubuklod ng dalawang subunit (Ku 70 at Ku 80) sa mapurol o halos mapurol na dulo ng target na DNA (Abbasi et al., 2021), na nagsisilbing scaffold upang magrekrut ng iba pang mga salik na may kaugnayan sa NHEJ sa lugar ng pinsala (Yang et al., 2020). Ang XRCC-4 at DNA ligase ay binubuo ng 334 at 911 amino acid, ayon sa pagkakabanggit, at ang XRCC4-DNA ligase IV complex ay nagpapasigla sa ligation ng mga dulo ng DNA (Chatterjee et al., 2015). Ang DNA end processing enzyme, na kilala rin bilang polynucleotide kinase 3′-phosphate, ay isang DNA end processing enzyme. Maaari nitong alisin ang 3′P group sa DNA at i-phosphorylate ang 5′OH group habang inaayos ang DSB. Kabilang din dito ang pagkukumpuni ng mga single-strand break (SSB) gamit ang SSB repair pathway (Chatterjee et al., 2015). Ang Protein kinase DNA-PKcs ay isang DNA-dependent protein kinase na binubuo ng isang catalytic subunit ng PIKKs (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) at ataxia telangiectasia mutated (ATM) family, pati na rin ang ATM at Rad3-related ATRs, strand breaks (DSBs) at single-strand breaks (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
Ang HDR ay isang mas tumpak at angkop na mekanismo ng pagkukumpuni dahil ang impormasyon ay kinokopya gamit ang buo na anyo ng homologous DNA duplex, bagama't nangangailangan ito ng presensya ng mga sister chromatids. Nangyayari ito sa panahon ng S/G2 phase ng mammalian cell cycle. Ang HDR ay pangunahing nangyayari sa mga yeast species, ngunit ang NHEJ ay kritikal sa mga mammal (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Ang kumpletong mekanismo ng pagkukumpuni ay ipinapakita sa Figure 1.
Dahil ang TNBC ay sanhi ng mga abnormalidad sa henetiko at epigenetiko, ang pagwawasto ng mga malignant na genomic/epigenomic na abnormalidad gamit ang CRISPR/Cas9 ay maaaring isang makatwirang paraan ng paggamot (Chen et al., 2019). Bukod pa rito, ang ilang mga transcription factor na kasangkot sa regulasyon ng transkripsyon na partikular sa selula ay maaaring magpakita ng mga natatanging katangian ng mga selula ng kanser, na nagmumungkahi na ang regulasyon ng transkripsyon ay maaaring isang mahusay na paraan para sa paggamot sa kanser (Drost et al., 2017). Ang paggamit ng mga molekular na katangiang ito ng mga tumor, tulad ng mga genetic, epigenetic at transcriptional defect, para sa pagbuo ng gamot ay maaaring mapabuti ang mga klinikal na resulta at mabawasan ang mga gastos sa screening. Ang CRISPR ay isang potensyal na tool sa pag-edit ng gene na hindi lamang makakatuklas at makakatukoy ng mga genomic target na sanhi ng kanser, ngunit maaari ding gamitin upang i-edit, sugpuin, at baguhin ang mga oncogene sa mga selula ng tao sa pamamagitan ng epigenetically (Talahanayan 1) (Ahmed et al., 2021). Ilang mga CRISPR screen ang isinagawa upang maghanap ng mga gene na nauugnay sa mga tumor suppressor, oncogene, at resistensya sa gamot. Ang paggamit ng CRISPR/Cas9 upang i-edit ang iba't ibang TNBC oncogenes ay ipinapakita sa Figure 2.
Pigura 2. Pag-edit ng gene ng iba't ibang TNBC oncogenes gamit ang CRISPR/Cas9 na nagreresulta sa nabawasang paglaki ng tumor at metastasis. Kabilang sa mga oncogenes na ito ang CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 at CXCR7, Crypto1, ROR1 at ST8SIA, na sangkot sa paglitaw at metastasis ng TNBC.
Ang paglipat, pagsalakay, at epithelial-mesenchymal transition (EMT) ng mga selula ng kanser ay nauugnay sa ITGA9. Ipinakita ng mga nakaraang pag-aaral na ang ITGA9 ay isang mahalagang manlalaro sa Notch pathway at gumaganap ng isang kawili-wiling papel sa rhabdomyosarcoma metastasis (Molist et al., 2020). Bukod pa rito, ang ITGA9 ay natagpuang malapit na nauugnay sa prognosis ng pasyente sa ilang uri ng tumor, kabilang ang kanser sa suso (Wang Z. et al., 2019). Bukod pa rito, ipinakita ng bioinformatics analysis ng ITGA9 na ang ekspresyon nito sa TNBC ay mas mataas nang malaki kaysa sa iba pang mga subtype ng kanser sa suso. Ang mataas na antas ng ITGA9 ay nauugnay sa metastasis ng tumor at pagbabalik sa dati sa mga pasyente ng TNBC. Ang pag-knockout ng ITGA9 sa pamamagitan ng CRISPR/Cas9 ay nagresulta sa mga katangiang parang cancer stem cell (CSC), tumor angiogenesis, paglaki ng tumor, at pagbawas ng metastasis sa pamamagitan ng pagtataguyod ng β-catenin degradation sa TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Ang Crypto-1 ay miyembro ng pamilyang TGF-β at mahalaga para sa maagang embryogenesis, pagpapanatili ng stem cell, at metastasis ng kanser (Ishii et al., 2021). Kilala rin bilang Tdgf-1, ito ay isang oncogenic GPI-anchored signaling protein na sangkot sa regulasyon ng pagbuo ng primitive streak, mesoderm at endoderm, pati na rin ang pagtatatag ng kaliwa/kanang asymmetry sa pag-unlad ng mga organo ng katawan habang nasa embryogenesis (Zhang et al., 2021b). Bukod pa rito, ipinakita na ang Cripto-1 ay kasangkot sa epithelial-mesenchymal transition (EMT) bilang isang stem cell marker (Zhang et al., 2021b). Ang EMT ay mahalaga hindi lamang para sa iba't ibang proseso tulad ng embryonic development, fibrosis at paggaling ng sugat, kundi pati na rin para sa pagsalakay ng kanser at metastasis. Bukod pa rito, ipinakita na ang Cripto-1 ay nakikipag-ugnayan sa apat na Notch receptor at nagpapahusay ng kanilang post-translational maturation (Brandstadter at Maillard, 2019). Ang Notch signaling pathway ay kilalang sangkot sa pagpapanatili ng mga selula ng kanser sa suso ng tao. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang CRISPR/Cas9-mediated knockout ng Crypto-1 ay pumipigil sa paglaki at metastasis ng kanser. Samakatuwid, ang Crypto-1 ay maaaring maging isang mahalagang therapeutic target para sa TNBC (Castro et al., 2015).
Ang XCL12 protein at ang chemokine receptor nito na CXC (CXCR4 at CXCR7) ay may iba't ibang papel sa paglaganap, paglaki, migrasyon, at pagsalakay ng mga selula ng kanser (Wu et al., 2015). Ang mga chemoreceptor na ito ay naiugnay sa pag-unlad ng TNBC sa pamamagitan ng maraming signaling pathway sa parehong in vivo at in vitro na mga modelo (Wu et al., 2015). Bilang karagdagan, ang pag-activate ng CXCR4 at CXCR7 ay nauugnay sa mas mataas na posibilidad na magkaroon ng metastasis at mahinang prognosis sa TNBC (Karn et al., 2022). Samakatuwid, ang pagpuksa ng CXCR4 at CXCR7 ay maaaring maging epektibong drug target genes para sa paggamot ng kanser sa suso, kabilang ang TNBC. Ginamit ng pag-aaral nina Yang et al. Yang et al (2019) ang CRISPR/Cas9 upang sabay na sugpuin ang mga gene na CXCR4 at CXCR7 at natuklasan na ang paglaganap, paglaki, migrasyon, at pagsalakay ng TNBC ay makabuluhang napigilan (Yang et al., 2019).
Ang pagtaas ng antas ng miR-3662, isang TNBC oncogene, ay naobserbahan sa mga tisyu ng kanser sa suso (Yi et al., 2022). Ang pagbagsak ng miR-3662 ay naipakita na pumipigil sa paglaki at metastasis ng tumor sa kanser sa suso kapwa in vivo at in vitro (Agarwal at Gupta, 2021). Ang HBP-1 ay isang malakas na inhibitor ng Wnt/-catenin signaling at malamang na responsable para sa paglaki ng mga TNBC cell na pinamagitan ng miR-3662. Kamakailan lamang, natuklasan ni Yi et al. na ang miR-3662-HBP1 axis ay nagreregula sa Wnt/-catenin signaling pathway sa mga TNBC cell (Yi et al., 2022). Dahil sa ekspresyon nito na partikular sa tumor, ang miR-3662 ay maaaring isang potensyal na therapeutic target para sa TNBC. Kaya naman, ang pagbagsak ng miR-3662 na pinamagitan ng CRISPR/Cas9 ay maaaring isang mahusay na pamamaraan para sa pagbuo ng mga bagong gamot para sa paggamot ng TNBC.
Ang UBR5 ay isang 300 kDa nucleophosphoprotein na natukoy bilang isang pangunahing regulator ng tumorigenesis, metastasis, at immune response sa iba't ibang uri ng kanser (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Ang UBR5 ay naiulat na mataas ang upregulated sa mga sample ng TNBC at pinasisigla ang function ng ERα sa pamamagitan ng pag-induce ng proliferation sa pamamagitan ng ubiquitin ligase activity nito (Bolt et al., 2015). Ang mga pag-aaral ng whole exome sequencing ng mga pangunahing sample ng TNBC ay nagpakita rin ng pagtaas ng expression ng UBR5, na nagmumungkahi ng papel nito sa pag-unlad ng TNBC. Bukod pa rito, ang CRISPR/Cas9-driven deletion ng UBR5 ay nagpakita ng makabuluhang pagsugpo sa TNBC metastasis at paglago sa mga experimental mouse model. Bukod dito, ang pagsasama ng UBR5 sa isang wild-type mouse model ay nagpanumbalik ng buong functionality nito, samantalang ang epektong ito ay hindi naobserbahan sa mga inactivated mutant strain (Liao et al., 2017). Ang kakulangan ng UBR5 ay nauugnay sa pagtaas ng apoptosis, nekrosis, at pagsugpo sa paglaki ng tumor sa TNBC dahil sa mahinang angiogenesis. Dahil sa pagkawala ng UBR5, nababawasan ang pagkalat ng tumor sa malalayong organo, at ang UBR5 ay nagdudulot ng abnormal na EMT pangunahin sa pamamagitan ng pagbabawas ng ekspresyon ng E-cadherin (Zhang at Weinberg, 2018). Kamakailan lamang, ipinakita na ang UBR5 ay isang napakahalagang salik sa transkripsyon ng PDL1 na dulot ng IFN-γ sa TNBC dahil sa kakulangan nito ng aktibidad sa ubiquitination ng E3. Ipinakita ng pagsusuri ng RNA transcriptome na ang UBR5 ay maaaring magkaroon ng sistematikong epekto sa mga gene na nauugnay sa IFN-γ pathway at nagtataguyod ng transactivation ng PDL1 sa pamamagitan ng pagtaas ng mga antas ng activation ng protein kinase RNA (PKR) at mga signal transducer at activator nito, transcription 1 (STAT1) at interferon regulatory factor 1 (IRF1). Gayunpaman, ang pinagsamang ablation ng UBR5 at PD-L1 expression na pinamagitan ng CRISPR/Cas9 ay may synergistic therapeutic effect kaysa sa alinman sa blockade lamang, na may malalim na epekto sa tumor microenvironment (Wu et al., 2022). Samakatuwid, ang CRISPR/Cas9 ay maaaring isang mahalagang kasangkapan upang mapigilan ang paggana ng UBR5, sa gayon ay pinipigilan ang TNBC metastasis at paglaki ng tumor.
Ang ROR1 ay isang type I transmembrane protein na ipinapahayag sa panahon ng kanser at pag-unlad ng embryo at natukoy bilang isang oncofetal protein (Nicholas Borcherding, 2014). Ang invasive na pag-uugali ng iba't ibang kanser sa tao ay nauugnay sa pagtaas ng ROR1. Nakamit ang mga magagandang resulta mula sa mga pag-aaral na in vivo at in vitro na kinasasangkutan ng mga therapeutic compound na tumatarget sa ROR1 (Chien et al., 2016). Ang mataas na antas ng ROR1 mRNA sa mga biopsy ng tisyu ng suso ay naiugnay din sa mga agresibong basal-like breast (BL) tumor at ang kanilang paglipat sa iba pang mga bahagi ng katawan. Bukod dito, ang overexpression ng ROR1 ay natukoy bilang isang prognostic marker para sa pag-unlad ng TNBC (Chien et al., 2016). Gayunpaman, ang pagpapatahimik sa ROR1 gamit ang CRISPR/Cas9 upang sugpuin ang paglaki at metastasis ng TNBC ay magiging isang epektibong estratehiya.
Ang proseso ng sialylation ay kinabibilangan ng pagdaragdag ng sialic acid sa mga glycoconjugates, na kinakatawan ng mga sialyltransferase (ST). Ang ST8SIA1 ay kabilang sa pamilya ng ST at gumaganap ng mahalagang papel sa pathogenesis ng iba't ibang sakit tulad ng lymphocytic leukemia at colorectal cancer (Chang et al., 2018). Ipinapakita ng pagsusuri ng RNA sequence na ang ST8SIA1 ay mataas ang ekspresyon sa tisyu ng suso ng mga pasyenteng may TNBC at positibong nauugnay sa mga mutasyon sa tumor suppressor gene na p53, na maaaring mag-ambag sa pathogenesis ng TNBC (Battula et al., 2017). Bukod pa rito, ang ST8SIA1 ay kasangkot sa metastasis at pag-ulit ng TNBC, na nagmumungkahi na ito ay gumaganap ng mahalagang papel sa paglitaw at pag-unlad ng TNBC. Sa isang in vitro model ng TNBC, ang pagbagsak ng ST8SIA1 ng CRIPSR/Cas9 ay ipinakita na humahadlang sa paglaki at metastasis (Battula et al., 2017). Ipinahihiwatig nito na ang CRISPR/Cas9 ay maaaring isang mahalagang kasangkapan para sa pagpigil sa tungkulin ng ST8SIA1 oncogene sa paggamot ng TNBC.
Ang NAT1 ay isang metabolic enzyme na nagpapabilis sa pagbuo ng mga phase II xenobiotic compound at ipinapahayag sa halos lahat ng tisyu ng tao. Maaaring gamitin ng NAT1 ang cofactor folate upang i-target ang acetyl-CoA (acetyl-CoA) kahit na wala ang aromatic amine substrate (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Ipinakita ng mga pag-aaral na kinokontrol ng NAT1 ang function ng matrix metalloproteinase 9 (MMP9) sa mga modelo ng selula ng kanser sa suso at pinoprotektahan laban sa reactive oxygen species (ROS) sa panahon ng glucose starvation (Wang et al., 2018). Ang pagtanggal ng NAT1 ay naipakita na pumipigil sa pyruvate dehydrogenase complex, na humahantong sa mitochondrial dysfunction (Wang L. et al., 2019). Bukod pa rito, ipinakita ng iba't ibang ulat na ang NAT1 inhibition gamit ang maliliit na molekula at siRNA silencing ay maaaring mabawasan ang invasiveness at pagdami ng mga selula ng kanser sa suso (Stepp et al., 2018). Kamakailan lamang, ginamit ang CRISPR/Cas9 upang sugpuin ang NAT1 sa linya ng selula ng kanser sa suso na MDA-MB-231, na nakakaapekto sa metabolismo ng selula depende sa antas ng ekspresyon nito. Ipinakita rin ng pag-aaral na ito na ang NAT-1 ay mahalaga para sa pag-unlad at metastasis ng TNBC (Carlisle et al., 2020).
Ang koordinadong transkripsyon ng mga oncogene ay kinokontrol ng mga super enhancer, transcription factor, at cofactor (Hnisz et al., 2015). Bukod pa rito, ang isang grupo ng mga cyclin-dependent kinase (CDK), tulad ng CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, at CDK13, ay kinakailangan para sa regulasyon ng transkripsyon. Kabilang sa mga ito, ang CDK7 ay kasangkot sa phosphorylation ng RNA polymerase II, na napakahalaga para sa pagsisimula at pagpapalawak ng transkripsyon ng oncogene sa pathogenesis ng TNBC. Sa isang mahalagang pag-aaral, ang pagtanggal ng CDK7 ng CRISPR/Cas9 ay pumigil sa TNBC, na nagpapahiwatig na ang pathogenesis ng TNBC ay nakadepende sa CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Ipinakita ng mga pag-aaral na ang mga mutasyon sa MYC at RBP (RNA binding protein) ay maaaring humantong sa apoptosis, habang ang mga single gene mutations sa MYC o RBP ay hindi nakakaapekto sa paglaki ng mga cancer cells (Einstein et al., 2021). Mahigit sa 1000 RBP sa human genome ang nasuri gamit ang isang CRISPR/Cas9-based library. Sa mga ito, 57 RBP ang natagpuang kritikal para sa paglaki ng mga cancer cells na may mataas na antas ng MYC (Wheeler et al., 2020). Bukod pa rito, ang YTHDF2 ay mahalaga para sa pagpapanatili ng paglaki ng TNBC cell at binabawasan ang dami ng methylated transcripts sa panahon ng high-level transcription at translation sa mga cancer cells na may mas mataas na MYC expression. Bukod pa rito, ang YTHDF2 ay hindi mahalaga para sa mga cancer cells, na hindi gaanong umaasa sa mataas na antas ng MYC upang pahabain ang survival ng mga pasyenteng may TNBC (Einstein et al., 2021), na nagmumungkahi na maaaring ito ay isang potensyal na therapeutic target para sa mga gamot na maaaring malampasan ang TNBC.
Ang mga zinc finger protein (ZNF) ay bumubuo ng humigit-kumulang 1% ng kabuuang genome ng tao. Ipinakita ng mga pag-aaral na kayang i-regulate ng ZNF ang pagdami ng selula sa iba't ibang uri ng kanser, tulad ng kanser sa atay, kanser sa suso, at kanser sa colorectal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Ang mga library na nabuo gamit ang CRISPR knockout ay ginamit upang i-screen ang iba't ibang tumor suppressor genes (TSGs) sa mga selula ng kanser sa suso (Shalem et al., 2014). Simula noon, ipinakita ng isang transcriptomic na pag-aaral ng mga selula ng kanser sa suso na tinanggal ng CRISPR/Cas9 ZNF319 na ang ZNF319 ay isang tumor suppressor gene na nagbabawas sa pagdami ng kanser sa suso at samakatuwid ay kasangkot sa iba't ibang potensyal na mekanismo ng pagbibigay ng senyas at iba pang mga biological function (Wang L. et al., 2022).
Ang Ferroptosis ay isang uri ng programmed cell death na nakadepende sa presensya ng iron. Alam na ang pag-unlad ng ferroptosis ay naiimpluwensyahan ng presensya ng lipid peroxides. Bukod pa rito, naiulat na ang PKCβII ay nagpapakita ng maagang lipid peroxidation, at ang pagtaas ng lipid peroxidation ay nauugnay sa ferroptosis. Ang pagsusuri sa isang library ng mga CRISPR/Cas9-mediated kinase inhibitors ay nagsiwalat na ang PKCβII ay kasangkot sa proseso ng lipid peroxidation, na mahalaga para sa ferroptosis sa mga MDA-MB-231 cells (Zhang et al., 2022). Samakatuwid, ipinahihiwatig nito na ang pagpuksa sa PKCβII ng CRISPR/Cas9 ay maaaring isang potensyal na target na tumor suppressor gene para sa paggamot ng mga sakit na may kaugnayan sa ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Ang resistensya sa gamot ay pinaniniwalaang responsable para sa humigit-kumulang 90% ng mga pagkamatay sa mga pasyenteng may kanser at isa sa mga pangunahing hamon sa paggamot sa kanser (Bukowski et al., 2020). Ipinapahiwatig ng mga resulta na ang sapat na bilang ng mga gene na may kaugnayan sa paglabas ng gamot, pagkukumpuni ng DNA, apoptosis at iba't ibang mga pathway ng cell signaling ay nauugnay sa resistensya sa gamot (Haider et al., 2020). Kabilang sa mga ito, ilang mga gene ang na-target ng mga tool ng CRISPR/Cas9 at nagpakita ng mga magagandang resulta sa pagbabawas ng resistensya sa gamot at pagpapataas ng bisa ng mga paggamot laban sa kanser (Vaghari-Tabari et al., 2022). Bilang karagdagan, ang mga high-throughput na CRISPR/Cas9 gene knockout screening libraries ay nasangkot sa pagbabago ng tungkulin ng mga potensyal na target ng gene na may resistensya sa gamot (Shalem et al., 2015). Upang matukoy ang mga gene na may resistensya sa paclitaxel, ginamit ang RNA sequencing kasama ang genome-wide sgRNA library screening upang matukoy ang walong kandidatong gene, kabilang ang histone deacetylase 9 (HDAC9), na nauugnay sa resistensya sa gamot sa mga pasyenteng may paulit-ulit na TNBC (B et al., 2020). Sa isa pang pag-aaral, naobserbahan ang pagtaas ng ekspresyon ng diserine/threonine at tyrosine protein kinase (DSTYK) sa panahon ng kaligtasan ng mga pasyenteng may TNBC na ginagamot ng mga gamot na anticancer. Bukod dito, ang CRISPR/Cas9-mediated knockdown ng DSTYK ay makabuluhang nagpahusay ng apoptosis ng mga selula ng kanser na lumalaban sa gamot in vitro (mga selula ng SUM102PT at mga selula ng MDA-MB-468) at isang in vivo TNBC model (Ogbu et al., 2021).
Bagama't may abnormal na pag-activate ang TNBC sa MAPK pathway, mahina ang klinikal na epekto ng mga MEK-targeted therapies. Ipinakita ng isang CRISPR/Cas9 genomic library screen na ang pagsugpo sa PSMG2 (proteome assembly chaperone 2) ay nagpapasensitibo sa mga TNBC BT549 at MB468 cells sa MEK inhibitor na AZD6244. Binago ng CRISPR/Cas9 knockdown ng PSMG2 ang normal na proteasome function, na humahantong sa autophagy-mediated disassembly ng PDPK1, sa gayon ay lalong nagpapabuti sa mga tumor cells sa mga TNBC mouse model na sapilitan ng AZD6244 (MEK inhibitor) at MG132 (proteasome inhibitor). Kaya naman, ang proteasome at MAP kinase (MEK) inhibitors ay maaaring ibigay nang synergistically upang mabawasan ang paglaganap ng tumor cell (Wang X. et al., 2022).
Ginamit din ang CRISPR/Cas9 upang masuri ang pagkawala ng tungkulin ng gene na humahantong sa resistensya sa TNBC (Shu et al., 2020). Ipinaliwanag nina Ge et al. ang mekanismo ng resistensya sa gamot ng mga selula ng kanser na ginagamot gamit ang JQ1, isang BET bromodomain inhibitor (BBDI), sa TNBC. Gamit ang CRISPR/Cas9, natuklasan nila na ang pagbura sa rb1 gene ay naging sanhi ng pagiging resistensya ng TNBC sa gamot na panlaban sa kanser na JQ1. Samakatuwid, mahalaga ang tungkulin ng rb1 sa tugon sa mga gamot na JQ1 sa TNBC. Iniulat din nila na ang paclitaxel ay isang CDK4/6 kinase/microtubule inhibitor, at ang pagsasama nito sa mga BBDI tulad ng JQ1 ay maaaring magbigay ng magagandang therapeutic na tugon sa TNBC na lumalaban sa gamot (Ge et al., 2020).
Ang transcriptional landscape ng long noncoding RNA (lncRNA) ay naiulat na responsable para sa resistensya sa neoadjuvant therapy sa TNBC. Ipinapakita ng pag-aaral na ito na limang magkakaibang MALAT1 lncRNA transcript ang mataas ang ekspresyon sa TNBC. Bukod pa rito, ang CRISPR/Cas9-mediated deletion ng MALAT1 ay nagpataas ng sensitivity ng mga TNBC BT-549 cells sa paclitaxel at doxorubicin, na nagmumungkahi ng isang potensyal na papel para sa resistensya ng MALAT1 sa TNBC (Shaath et al., 2021).
Ang mga mutasyon sa BRCA1 (BRCA1m) ay magkakaiba at samakatuwid ay mahirap matukoy. Ang pag-target sa PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), ang synthetic lethal partner ng BRCA1, ay maaaring magpataas ng chemosensitivity ng gamot sa TNBC. Gamit ang CRISPR/Cas9, ang pagtanggal ng PARP1 ay nagpataas ng sensitivity ng mga gamot na anticancer tulad ng doxorubicin, gemcitabine at docetaxel sa mga mBRCA1 mutant TNBC cells, na nagmumungkahi na ang PARP1 ay kasangkot din sa resistensya sa gamot sa TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Ang mga mutasyon sa mga tumor suppressor gene na BRCA1 o BRCA2 ay kilalang nagpapataas ng posibilidad na magkaroon ng kanser sa suso sa mga tao. Ang paggamot sa mga pasyenteng ito ay nangangailangan ng paggamit ng mga PARP inhibitor. Bukod pa rito, naipakita na ang pag-knockout ng nucleotide salvage factor DNPH1 gamit ang CRISPR/Cas9 ay maaaring mag-alis ng nakalalasong nucleotide 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) monophosphate, sa gayon ay pinahuhusay ang tugon ng mga selulang kulang sa BRCA sa sensitivity sa mga PARP inhibitor (Fugger). et al., 2021). Kaya naman, ang mga CRISPR/Cas9 at PARP1 inhibitor ay maaaring maging isang mahalagang estratehiya sa paggamot para sa TNBC.
Ang penetrant glycoprotein (P-gp) gene ay isang multidrug resistance gene na karaniwang tumataas ang antas ng resistensya sa humigit-kumulang 41% ng lahat ng TNBC (Sun et al., 2020). Ang paglabas ng gamot na dulot ng P-gp ay natukoy bilang isang pangunahing regulator ng resistensya sa gamot sa kanser sa suso. Ang mga P-gp inhibitor ay nagpakita ng pagtaas ng sensitivity sa mga gamot na anticancer sa kanser sa suso (Famta et al., 2021). Kaya naman, ang CRISPR/Cas9-mediated ablation o pagsugpo sa mga P-gp at P-gp inhibitor ay maaaring napakahalagang mga pamamaraan upang malampasan ang resistensya sa gamot sa TNBC.
Ang ATP-binding cassette transporter G2 (ABCG2) ay kilalang nagdudulot ng resistensya sa gamot sa TNBC (Palasuberniam et al., 2015), bagama't sa kasalukuyan ay walang mga ulat tungkol sa ugnayan sa pagitan ng CRISPR/Cas9 at ABCG2 silencing at tumor suppressor gene inactivation. Maaaring mapahusay ng PTEN ang pag-activate ng ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Samakatuwid, ang paggamit ng CRISP/Ca9 upang alisin ang ABCG2 at pagsasama nito sa isang ABCG2 inhibitor ay maaaring isang angkop na paggamot upang malampasan ang resistensya sa gamot sa TNBC. Binabanggit sa Talahanayan 2 ang CRISPR/Cas9 na nagta-target sa lahat ng resistance genes.
Talahanayan 2. Tinatarget ng CRISPR/Cas9 ang iba't ibang gene na lumalaban sa TNBC upang gawing sensitibo ang mga selula sa mga gamot na anticancer.
Ang mga library ng CRISPR/Cas9 ay mga potensyal na kagamitan para sa pag-screen ng mga mutasyon ng gene na nauugnay sa pathogenesis ng kanser (Chan et al., 2022). Ang pamamaraang ito ng screening ay kinabibilangan ng apat na hakbang tulad ng (a) pagbuo ng library, (b) lentiviral transduction, (c) phenotypic screening, at (d) pagsusuri ng target gene. Bagama't ang TNBC ay may abnormal na pag-activate ng MAPK pathway, ang klinikal na prognosis ng MEK targeted therapy para sa mga pasyenteng TNBC na may mga mutasyon sa mga tumor suppressor gene tulad ng PTEN, RB1, at TP53 ay napakasama.
Bukod pa rito, sinubukan ng isang gene knockout screen gamit ang CRISPR/Cas9 ang pinakamalakas at pinakamapiling molekula, ang dehydrocatrol, na sagana sa mga katas ng bulaklak at dahon ng Guatemala, upang maunawaan ang epekto ng dehydrocatrol sa MDA-MB-231. Mga mekanismo ng selective cell cytotoxicity. Mga katangian ng mesenchymal stemness ng mga TNBC subtype. Ipinakita rin ng CRISPR/Cas9-based screen na ito na ang HSD17B11, isang gene na nagko-code ng 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 11, ay mataas ang ekspresyon sa mga MDA-MB-231 cell at nagreresulta sa dehydrofalcarinol na partikular para sa mga MDA-MB-231 cell (Grant et. al., 2020). Kaya, ipinahihiwatig nito na ang CRISPR/Cas9 genomic screening ay may malaking potensyal sa pagtukoy ng mga mekanismo na pinagbabatayan ng mga anticancer properties ng mga potensyal na natural compound.
Bukod pa rito, ang kahinaan ng TNBC sa kanser ay pinag-aralan gamit ang isang walang kinikilingang genome-wide in vivo CRISPR/Cas9 screen, na nagpakita ng ugnayan sa pagitan ng oncogenic at tumor suppressor pathways. Ang mga pangunahing bahagi ng mTOR at Hippo pathways ay naiulat na gumaganap ng mahahalagang papel sa regulasyon ng tumor sa TNBC. Bukod pa rito, ipinakita ng mga pag-aaral na ang pharmacological inhibition ng mTORC1/2 at YAP oncoprotein ay epektibong pumipigil sa pathogenicity ng TNBC gamit ang isang in vitro drug-matrix synergy model at in vivo patient-derived xenografts. Bukod dito, ang Torin-1-mediated mTORC1/2 inhibition ay nagpapahusay sa macropinocytosis, samantalang ang verteporfin-induced YAP inhibition ay humahantong sa pagkamatay ng TNBC cell. Kung pagsasama-samahin, ang mga resultang ito ay nagpapakita ng kapangyarihan at katatagan ng genome-wide in vivo CRISPR screening upang matukoy ang mga bago at epektibong paggamot para sa TNBC (Dai et al., 2021).
Ang dysregulation ng immune system ay isang mahalagang salik sa tumorigenesis. Iniiwasan ng mga selula ng kanser ang immune clearance sa pamamagitan ng paglampas sa mga mekanismo ng depensa, kabilang ang panghihimasok sa aktibidad ng mga immune cell sa tumor microenvironment at pagkompromiso sa immune system. Samakatuwid, ang pagbuo ng isang pinahusay na immune system ay maaaring isang mahalagang paraan sa paglaban sa mga tumor. Ang paggamit ng CRISPR/Cas9-based gene modification ay tumutugon sa ilang mga isyu na may kaugnayan sa immune dysfunction mula sa iba't ibang pananaw. Ang CRISPR/Cas9 ay ginamit upang mapabuti ang antitumor immunity laban sa kanser sa suso sa pamamagitan ng mga sumusunod na pathway (Larawan 3).
Pigura 3. Ang immunotherapy ng CRISPR/Cas9 ay nagta-target sa mga TNBC cell. Ang pagkawala ng CDK5 at ang pagbagsak ng PDL1 at CD155 ay nagpapahusay sa immune system. Gayundin, ang pagkawala ng A2AR at ang pagbagsak ng mga TAA tulad ng HER2, mucin 1 at TEM8 ay nagpataas ng kahusayan ng mga CAR-T cell sa pagpatay sa mga cancer cell. Ipinakita ng CRISPR/Cas9-driven T cell screening na ang pagkagambala sa p38 kinase ay nagpapahusay sa aktibidad ng T cell laban sa tumor. Ang mga T cell na binago ng CRISPR/Cas9 ay nagpapataas ng ekspresyon ng TCR (T cell receptor), na nagreresulta sa pagkakaroon ng aktibidad ng T cell laban sa tumor.
Ang layunin ng immunotherapy ay pasiglahin ang immune system na atakehin ang mga selula ng kanser. Ang labis na ekspresyon ng mga immune checkpoint protein ay karaniwang pumipigil sa mga reaksiyong autoimmune ngunit maaaring makatulong sa mga kanser na maiwasan ang mga ito (Topalian et al., 2015). Pinipigilan ng mga protinang ito ang mga reaksiyong immune sa pamamagitan ng pagbigkis sa mga receptor sa ibabaw ng mga immune cell. Maraming checkpoint protein (tulad ng CD155 at PD-L1) ang tumatarget sa PD-1 receptor sa mga immune cell at ipinapahayag sa kanser sa suso, lalo na sa TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Ang pagbagsak ng PD-L1 o ng receptor nito gamit ang CRISPR/Cas9 ay maaaring magpasigla sa immune system na atakehin ang mga tumor ng TNBC (Yahata et al., 2019). Bukod pa rito, ang pagbaba ng ekspresyon ng PD-L1 sa pamamagitan ng CRISPR/Cas9-mediated deletion ng CDK5 ay naipakita na pumipigil sa paglaki ng tumor in vitro at in vivo (Deng et al., 2020). Ang pagpigil sa paglago sa mga in vitro at in vivo na modelo ng kanser sa suso ay nagmumungkahi na ang pagbawas ng CD155 na namamagitan sa shRNA ay maaaring magkaroon ng therapeutic effect sa kanser sa suso (Gao et al., 2018).
Ang mga CAR T cell ay nagpapahayag ng mga CAR na kumikilala sa mga tumor-associated antigen (TAA) at maaaring gumamit ng knockdown ng mga checkpoint protein upang mapahusay ang kanilang aktibidad (Li C. et al., 2020). Mayroong iba't ibang potensyal na target para sa CAR T cell therapy sa kanser sa suso, kabilang ang ilang TAA tulad ng HER2, mucin1, at TEM8 (Bajgain et al., 2018). May ebidensya na ang mga CAR T cell na nagta-target sa mesothelin (overexpressed sa mga TNBC BT-459 cell) ay mas epektibo laban sa kanser kapag ang PD-1 ay na-knockout gamit ang CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Gayunpaman, ang paghihiwalay ng mga T cell mula sa mga pasyente at pagkatapos ay pag-edit ng mga ito ex vivo ay isang proseso na matrabaho at matagal. Bagama't maaaring mabawasan ng mga universal T cell ang mga kinakailangan sa paghihiwalay, ang mga donor T cell na nagpapahayag ng human leukocyte antigen (HLA) class I at T cell receptor (TCR) ay dapat alisin upang maiwasan ang mga abnormalidad sa graft-versus-host (Ren et al., 2017). , 2017a). Gamit ang CRISPR/Cas9, sabay-sabay na maaalis ng HDR ang TCR at HLA at maaalis ang gene na nagko-code ng CAR. Ipinakita ng mga pag-aaral na maaaring gamitin ang CRISPR/Cas9 upang magpasok ng mga anti-CD19 CAR sa TCR locus, sa gayon ay mahusay na nakakagawa ng mga CAR nang hindi nauubos ang mga T cell (Dimitri et al., 2022). Nabuo ang mga teknolohiyang multiplex upang makabuo ng mga allogeneic CAR T cell sa pamamagitan ng sabay-sabay na pag-aalis ng TCR, beta-2-microglobulin (B2M), HLA-I subunit at iba pang mga protina tulad ng PD-1 at CTLA-4, na maaaring may mas mataas na anti-cancer properties laban sa TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Ang paggamit ng CRISPR/Cas9 ay maaaring mapabuti ang bisa ng mga CAR-T cell. Ang adenosine ay kilalang may mga immunosuppressive na katangian at maaaring mabawasan ang anticancer immunity sa pamamagitan ng pagharang sa function ng T cell at pag-activate ng adenosine A2A receptors (A2AR) (Vigano et al., 2019). Ang pagpapatahimik sa A2AR gamit ang CRISPR/Cas9 ay makabuluhang nagpabuti sa bisa ng mga CAR-T cell in vivo (Giuffrida et al., 2021). Ang mga T cell ay kilalang nagpapakita ng iba't ibang phenotypic na katangian tulad ng cellular expansion, differentiation, oxidative stress at genomic stress. Ang CRISPR/Cas9-based T cell screening ay nagpakita ng pagkagambala ng 25 iba't ibang T cell receptor kinases. Kabilang sa mga ito, ang pagtanggal ng p38 kinase ay ipinakita na nagpapahusay sa antitumor activity ng mga T cell, na nagpapahiwatig na ang p38 kinase ay isang pangunahing regulator ng regulasyon ng CAR-T cell (Gurasamy et al., 2020).
Ang mga T cell ay maaaring ma-genetically modified gamit ang CRISPR/Cas9 upang makagawa ng mga highly expressed TCR. Ang paglilipat ng mga genetically modified T cell sa mga pasyente ay nagpakita ng mas malakas na anticancer activity kaysa sa endogenous T cells. Samakatuwid, ang mga endogenous TCR ay maaaring makipagkumpitensya sa mga genetically altered TCR sa mga pasyente, na maaaring makaapekto sa potensyal ng cancer immunotherapy. Upang malampasan ang problemang ito, ang paggamit ng CRISPR/Cas9 upang alisin ang endogenous TCR-β sa mga recipient cell at kasunod na ilipat ang mga TCR-β T cell sa mga pasyenteng may kanser ay maaaring magpakita ng mas mahusay na anti-cancer immune responses nang hindi nangangailangan ng endogenous TCR sexual competition (Fan et al. 2018). Kaya, maliban sa mga CRISPR-modified T cells, ang mga TCR ay isang libong beses na mas sensitibo sa mga tumor antigens kaysa sa mga normal na TCR-transduced T cells. Bukod pa rito, sa iba't ibang leukemia, ang mga altered T cells na nabuo ng γδ TCR+ CRISPR ay nagpapakita ng mas mataas na expression ng CD4+ at CD8+ T cells kaysa sa karaniwang TCR transfer (Legut et al., 2018). Kaya naman, ang mga binagong T cell na nabuo ng CRISPR/Cas9 ay maaaring isang epektibong paraan ng immunotherapy upang malampasan ang TNBC.
Ang mga integrin ay mga molekula ng pagdikit ng selula na nasa mga cellular transmembrane at nagtataguyod ng pagbubuklod ng mga selula sa extracellular matrix (ECM) (Hamidi at Ivaska, 2018). Ang dysregulation ng mga integrin ay nauugnay sa pag-unlad at paglipat ng kanser sa pamamagitan ng pagbabago sa extracellular matrix, na humahantong sa kaligtasan ng mga selula ng kanser sa sirkulasyon (Hamidi at Ivaska, 2018). Ang CRISPR/Cas9-mediated integrin knockdown ay nagpapabagal sa paglala ng tumor, metastasis, at kolonisasyon sa TNBC. Ang knockdown ng integrin a5 (ITGA5) ay naiulat na nakakabawas sa paglipat at paglala ng selula sa iba pang mga kanser tulad ng kanser sa baga (Ju et al., 2017), na nagmumungkahi na ang integrin a5 ay maaari ring maging isang mahalagang salik sa pathogenesis ng TNBC.
Ang pagbuo ng mga knockout mice gamit ang tradisyonal na embryonic stem (ES) cell methods ay isang prosesong matrabaho, matagal, at hindi episyente. Inaabot ng ilang buwan at taon para ma-target ang mga ES cell sa pamamagitan ng homologous recombination, magparami ng mga chimeric mice, at pagkatapos ay i-cross ang mga ito sa mga heterozygous mice para makagawa ng mga homozygous na supling. Kinakailangan ang kumplikadong crossbreeding upang lumikha ng mga daga na may maraming genetic mutations. Gayunpaman, maraming problema ang lumitaw kapag gumagamit ng mga daga na nabuo sa pamamagitan ng ablation ng mga ES cell gamit ang CRISPR/Cas9 o sa pamamagitan ng microinjecting ng mga CRISPR/Cas9 component sa mga single-cell fertilized egg. Halimbawa, ang pagpapakilala ng mga pagbabago ay kadalasang nangyayari sa mga biallelic loci at hindi partikular sa gene. Kamakailan ay naiulat na ang mga ES cell na gumagamit ng teknolohiyang CRISPR/Cas9 ay maaaring sabay-sabay na magpasok ng mga biallelic mutations sa hanggang 5 gene (Nishizono et al., 2021). Para sa layuning ito, ang Cas9 mRNA at limang gene-specific gRNA ay sabay-sabay na na-transfect sa mga ES cell. Itinatampok nito ang pangako at bisa ng pamamaraang ito, bagama't maaaring naipasa ang mga mutasyong ito noong pinarami ang mga founder lines upang makagawa ng quintuple knockout mice. Iniulat din ng pag-aaral ang isang nakakagulat na pagtuklas: Hindi na kinakailangan ang mga ES cell upang lumikha ng mga genetically modified na daga. Sa halip, upang alisin ang mga partikular na produkto ng gene, ang Cas9 mRNA at gRNA ay initurok sa mga single-cell stage embryo. Bilang resulta, nalikha ang mga knockout founder lines na maaaring gamitin sa teorya upang pag-aralan ang mga kahihinatnan ng pagtanggal ng gene sa mga daga (Qin et al., 2016). Kaya, pinapayagan ng CRISPR/Cas9 ang paglikha ng mga transgenic na daga upang gamutin ang TNBC sa mas mababang gastos kaysa sa tradisyonal na genetic engineering. Gamit ang CRISPR/Cas system, isang bagong knockout mouse model ang nabuo na maaaring matagumpay na magpakilala ng mga point mutations sa isa o higit pang endogenous genes sa TNBC. Batay sa konseptong ito, ang mga modelo ng hayop ng TNBC ay maaari ring mabuo gamit ang CRISPR/Cas9-mediated deletion ng BRCA1 at p53, na nagreresulta sa pagkawala ng pagkukumpuni ng HR, genomic instability, at mutant phenotypes (Annunziato et al., 2020).
Sa kasalukuyan, iba't ibang pamamaraan tulad ng mammography, magnetic resonance imaging (MRI) at ultrasound ang ginagamit upang masuri ang TNBC. Gayunpaman, ang mga pamamaraang ito ay may ilang mga limitasyon. Ang mammography ay ginagamit upang masuri ang lokal na tisyu ng suso sa halip na metastases, kung saan ang mga selula ng kanser ay lumipat sa ibang mga organo. Ang Ultrasonography ay hindi isang maaasahang pamamaraan para sa pag-diagnose ng TNBC (Chen at Lee-Felker, 2023). Ang MRI ay may mas mataas na sensitivity kaysa sa ultrasound at mammography, ngunit limitado ang diagnostic accuracy nito (Sha at Chen, 2022). Ang tissue biopsy ay isang invasive na paraan upang matukoy ang mga selula ng kanser. Gayunpaman, sa ilang mga kaso, maaaring hindi makita ng isang biopsy ang cancerous tissue kung ang karayom ay lumayo sa lugar na pinag-aaralan. Bukod pa rito, ito ay napakamahal at maaaring maging traumatiko para sa pasyente. Ang TNBC ay isang heterogeneous na uri ng kanser, kaya ang isang biopsy ay maaaring hindi magbigay ng sapat na impormasyon tungkol sa uri ng kanser. Samakatuwid, ang isang bagong diagnostically reliable na pamamaraan para sa pag-detect ng TNBC ay agarang kailangan. Ang CRISPR/Cas9 ay maaaring magsilbing isang lubos na sensitibo at minimally invasive na alternatibo para sa diagnosis ng kanser sa suso. Para dito, maaaring gamitin ang mga estratehiyang nakabatay sa CRISPR/Cas9 upang mapabuti ang mga pamamaraan ng PCR para sa diagnosis ng TNBC. Una, ang mga protina ng Cas9 at cpf1 ng sistemang CRISPR ay ginagamit upang alisin ang mga non-specific na DNA, at pagkatapos ay makikilala ng dalawang protina na ito (Cas9 at cpf1) ang sequence ng PAM bago magbigkis sa target na DNA (Deepak Singh et al., 2021). Kaya, matutukoy ng PCR ang mga mutasyon na nauugnay sa pag-unlad ng kanser. Ilang pag-aaral ang gumamit ng estratehiyang nakabatay sa CRISPR na ito upang matukoy ang iba't ibang mutasyon sa iba't ibang kanser (Safari et al., 2019). Kaya, maaaring mabawasan ng mga pamamaraan ng PCR na nakabatay sa CRISPR ang pagdepende ng diagnosis ng TNBC sa mga invasive na pamamaraan tulad ng immunohistochemistry na nakabatay sa biopsy.
Ang mga pagbabago sa genotypic sa regulasyon ng hormone receptor ay naipakita rin sa TNBC (Chen at Russo, 2009). Ang mga estratehiya ng CRISPR/Cas9-based PCR gamit ang mga microarray para sa mga point-of-care diagnostic ay maaaring epektibong masubaybayan ang mga mutasyong ito (Hajian et al., 2019). Maaari rin itong magbigay sa mga tagapagbigay ng pangangalagang pangkalusugan ng mga kaugnay na impormasyon tungkol sa mga partikular na mutasyon sa mga pasyenteng may TNBC, na maaaring makatulong na mapabuti ang kanilang kurso ng paggamot. Gayunpaman, ang pinagsamang pamamaraan na ito ay may mga limitasyon. Samakatuwid, kinakailangan ang malawak na pagsisikap sa pananaliksik bago magamit ang pamamaraang CRISPR/Cas-PCR na ito sa pangangalagang pangkalusugan para sa diagnosis ng TNBC (Yang et al., 2019).
Oras ng pag-post: Oktubre 14, 2024